STANOVENIE BIOLOGICKEJ ÚČINNOSTI HEPARÍNU V KOAGULAČNÝCH FAKTOROCH

STANOVENIE  BIOLOGICKEJ ÚČINNOSTI HEPARÍNU V KOAGULAČNÝCH FAKTOROCH

Skúšaná vzorka sa inkubuje so známym nadbytkom trombínu a chromogénneho substrátu špecifického pre trombín a meria sa zvýšenie absorbancie (v závislosti od množstva uvoľneného 4-nitroanilínu) pri 405 nm. Toto zvýšenie je nepriamo úmerné obsahu heparínu vo vzorke.

Skúšané roztoky. Prípravok sa rozpustí podľa údajov na štítku a zriedi sa vhodným tlmivým roztokom (napr. chloridom sodným R 7 g/l, citrónanom disodným R 6 g/l, pH 7,3) tak, aby obsahoval asi 0,25 I. U. heparínu na mililiter. Pripravia sa série riedení do 1:32 s použitím tlmivého roztoku (pozri Referenčné roztoky) a nechajú sa 30 min stáť.

Referenčné roztoky. Referenčný prípravok heparínu sa zriedi tlmivým roztokom (napr. trometamol R 6 g/l, kyselina etyléndinitrilotetraoctová R 2,2 g/l, chlorid sodný R 11,3 g/l,
pH 8,4). Pripravia sa série riedení do 1:32.

Pipetou sa prenesie po 200 µl skúšaného roztoku, referenčného roztoku alebo slepého roztoku (tlmivého roztoku) a 200 µl roztoku antitrombínu III R (3 I. U./ml) do série plastových skúmaviek. Zmes sa nechá 30 min stáť a pridá sa 200 µl roztoku trombínu hovädzieho R
(20 I. U./ml). Dôkladne sa premieša v mixéri typu vortex a udržuje sa 90 s pri teplote 37 °C.

Pripraví sa roztok chromogénneho substrátu špecifického pre trombín v koncentrácii zodpovedajúcej najmenej dvojnásobku hodnoty K_m (Michaelisova konštanta).

Roztok substrátu sa zahreje na 37 °C a pridá sa 200 µl do každej skúmavky so skúšanou vzorkou, referenčným prípravkom a slepým roztokom. Dôkladne sa premieša v mixéri typu vortex a 90 s sa inkubuje pri teplote 37 °C. Reakcia sa zastaví pridaním 200 µl roztoku kyseliny octovej R (500 g/l C₂H₄O₂) a meria sa absorbancia pri 405 nm.

Vypočíta sa obsah heparínu v skúšanom prípravku bežnými štatistickými metódami (napr. 5.3. Štatistické vyhodnotenie výsledkov stanovenia biologickej účinnosti a skúšok).