BACTERIOLOGIE- VIRUSOLOGIE

Bacteriologie generala

1.Coloratia Gram- principiu,metodologie, interpretare

- Principiu-evidentiaza forma, gruparea si afinitatea tinctoriala a germenului, clasificand germenii Gram pozitivi si Gram negativi pe baza structurii fizico-chimice a peretelui celular. Germenii Gram pozitivi au peretele gros, dar simplu care rezista la decolorare si pastreaza culoarea violet initiala. Germenii Gram negativi au peretele subtire dar complex ca structura dupa culorare devenind rosii.

- Metodologie- frotiul uscat si fixat se acopera cu violet de gentiana 2 minute.

- mordansarea-se acopera lama cu Lugol care se mentine 2 minute, apoi se varsa

fara a se spala.

-diferentierea-se acopera frotiul cu un amestec alcool-acetona si se imprima

miscari de inclinare a lamei. Dupa 10 secunde se spala frotiul cu apa de la

robinet.

-recolorarea-se acopera frotiul cu fuxina Ziehl diluata 1/10 timp de 1-2 minute

Se spala cu apa de la robinet. Se usuca si se examineaza la microscop.

2.Coloratia Ziehl-Neelsen - principui, metodologie, interpretare

- Principiu-bacilii acido-alcoolo-rezistenti au in structura peretelui substante lipidice care se coloreaza greu dar odata colorati nu-si pierd culoarea nici cu un decolorant puternic ramanand colorati in rosu. Celelalte microorganisme, impreuna cu elementele celulare, se decoloreaza si, dupa recolorare, devin albastre.

-Metodologie-se acopera frotiul cu fuxina fenicata. Se aseaza flacara sub frotiu si se mentine

pana la emisie de vapori. Incalzirea dureaza 5 minute. Se inlatura fuxina, se

spala lama cu apa de la robinet .

-decolorarea cu o solutie de acid sulfuric 20% timp de 1 minut. Se spala pe

ambele fete.

-recolorarea cu albastru de metilen 1% timp de 1 minut. Se spala cu apa de la

robinet. Se usuca si se examineaza la microscop cu obiectivul cu imersie.

In coloratia Ziehl-Neelsen bacilii alcool-acido rezistenti apar rosii, iar restul florei si elementele celulare colorate cu albastru.

3.Formele fundamentale ale bacteriilor, asezarea bacteriilor, exemple.

-forme-coci (sferici)

-cocobacili(intermediari intre coci si bacili)

-bacili(bastonase drepte sau incurbate)

-vibrioni(forma de virgula)

-spirili si spirochete(forma spiralata)

-filamente lungi ramificate ce se pot fragmenta

-asezare-in diplo:diplococi, diplobacili

-in lanturi de lungimi diferite:streptococi

-in cub

-neregulat sau in ciorchine de strugure:stafilococi

-formeaza litere chinezesti:bacilul difteric

4.Elementele structurale obligatorii ale celulei bacteriene-exemple.

-peretele celular

-citoplasma-membrana citoplasmatica

-mezozomi

-ribozomi

-plasmide

-incluzii granulare

-nucleul

5.Elementele structurale facultative ale celulei bacteriene-exemple.

-capsula

-cilii(flagelii) bacterieni

-fimbriile(pilii)

-sporii

6.Caractere de cultura ale bacteriilor pe medii lichide-exemple.

-turbiditatea-omogen, in toata masa mediului de cultura: stafilococ, Salmonella, Proteus

-inegal, sub forma unui depozit grunjos la partea inferioara si pe peretii eprubetei

cu un aspect mai limpede in celelalte doua treimi supeioare:streptococul β-hemolitic.

-depozit floconos si aderent la fundul eprubetei, mediul fiind clar in rest:bacilul

antraxului

-aspecte la suprafata mediului-formare de val subtire la suprafata:vibrion holeric, C.diphteriae

-formarea unei pelicule fine:unele tulpini de Proteus

-formarea unei membrane groase, rugoase, incretite la suprafata,

restul mediului fiind limpede:bacilul tuberculos

-formarea unei membrane uscate "scuamoase":Bacillus subtillis

-formarea unui inel aderent la jonctiunea dintre concavitatea

nivelului superior al lichidului si peretii eprubetei:tulpini E.coli

-culoare-aparitia unei coloratii diferite de cea a mediului neinsamantat

-miros caracteristic-aromat, de flori de tei: Pseudomonas

-fecaloid: E.coli

-putrid: Proteus

-corn ars: bacilul tetanic

7.Caractere de cultura ale bacteriilor pe medii solide-exemple

-dimensiuni-mici: Haemophylus,Brucella, Bordetella

-mijlocii: Proteus, Salmonella, Streptococcus

-mari: Staphylococcus, E.coli

-forma: rotunde, ovalare, dendritice, lenticulare, filamentoase

-suprafata-netede

-rugoase

-bombate: Stafilococul, E.coli, Vibrionul holeric

-mamelonate: Bacilul tuberculos, Bacilii difterici

-aplatizate: Pseudomonas

-ombilicate: Pneumococ

-contur: circular, regulat, intreg, incretit, ondulat, cu prelungiri

-transparenta-opacitate-hiperopacitate: vibrion holeric

-transparente: Haemophzllus, Shigella

-translucide: Salmonella, Proteus

-opace: Stafilococ, E.coli

-stralucire-matitate-lucioase: Streptococ β-hemolitic

-mate

-uscate, granulare: bacilul tuberculos

-consistenta-friabile:bacilul tuberculos

-mucoase:Klebsiella, Streptococ β-hemolitic

-untoasa

-spumoasa

-aderenta la mediu-neaderente: streptococ, stafilococ, Shigella

-aderente: bacilul piocianic

-incastrate in mediu

-culoare-prin pigment propriu-albe: stafilococ alb

-galben-aurii: stafilococ aureu

-galben-citrin: stafilococ citrin

-verde fluorescent: Pseudomonas aeruginosa

-portocalii: streptococ de grup B

-virarea culorii indicatorului din mediu

-mirosul

-hemoliza-dimensiunile zonei-mari: stafilococ β-hemolitic, streptococ α-hemolitic

-mici: stafilococ

-gradul hemolizei-partiala de tip alfa: streptococ α-hemolitic

-completa de tip beta: streptococ β-hemolitic

-de tip gamma: streptococii nehemolitici

-de tip"cald-rece"

-forma-"S"-contur circular, suprafata neteda, bombate

-"R"-contur incretit, suprafata rugoasa, turtite

8.Sterilizarea cu ajutorul caldurii uscate-principii, exemple.

-incalzirea la rosu-trecerea prin flacara becului de gaz a obiectului care contine germeni microbieni(anse bacteriologice, pipete Pasteur si a gurii tuburilor care contin medii de cultura)

-sterilizarea prin aer cald-se realizeaza in etuva la 160-180^oC timp de o ora(obiecte de laborator din sticla, seringi Luer din sticla, instrumentar chirurgical, substante grase, pulberi termostabile)

-incinerarea-presupune arderea cu reducere la cenusa(materiale de plastic, reziduuri organice solide, gunoiul, cadavrele si carcasele animalelor de experienta).

9.Streilizarea cu ajutorul caldurii umede-principii, exemple.

-prin autoclavare-se bazeaza pe relatia care exista intre temperatura vaporilor supraincalziti si presiune

-autoclavele cu perete simplu-pentru sterilizarea solutiilor si materialului contaminat din

laborator, sticlaria pentru culturi de celule si aparatele de filtrare

-autoclavele cu manta de abur-pentru materiale chirurgicale din bumbac, obiecte si

instrumente din cauciuc, instrumentar metalic, seringi cu componente metalice

-autoclavul vertical cu manta de abur-pentru solutii, materiale chirurgicale, seringi, sticlarie

cu destinatie speciala

-autoclavul cu evacuare gravitationala a aerului

-pasteurizare-reprezinta o metoda de sterilizare incompleta, distrugand formele vegetative, nu si pe cele sporulate; consta in trecerea lichidelor intr-un strat subtire peste o suprafata incalzita

(60-90^oC) o anumita perioada de timp, urmata de o racire brusca

-tyndalizarea-in medii care permit germinarea sporilor, incalzirile repetate omoara atat formele vegetative existente initial, cat si pe cele germinate din spori in intervalele dintre incalziri

10.Medii de cultura utilizate pentru izolarea bacteriilor-exemple

-medii simple-lichide:bulion, apa peptonata

-solide:geloza simpla

-medii complexe-mediul geloza sange(stafilococi, streptococi, pneumococi)

-medii elective-mediul Loeffer(bacilul difteric)

-medii selective-mediul Lowenstein Jensen

-mediul hiperclorurat solid Chapman(stafilococi manito-pozitivi)

-mediul Tinsdale, mediul Gundel-Tietz(bacilul difteric)

-mediul Rogose(lactobacili)

-medii pentru izolarea enterobacteriilor

-mediul PPLO

-mediul Diudonne

-medii de imbogatire-mediul OCST(bacil difteric)

-mediul hiperclorurat lichid Chapman(stafilococi)

-mediul Picke(streptococ β-hemolitic grup A)

-mediul Muller-Kauffmann-Salmonella

-medii diferentiale-mediul Drigalski(bacteriile are fermenteaza lactoza)

-medii pentru punerea in evidenta a anumitor proprietati biochimice

-medii politrope(TSI, MIU, MILF)

-mediul Hiss

-mediul Clark-Lubs

-mediul Simons

-mediul cu fenilalanina

-mediul cu lizina

-mediul cu esculina

-medii pentru cultivarea bacteriilor anaerobe-mediul Veillon

-mediul Tarozzi

-mediul Willis-Hobbs

-medii pentru cultivarea fungilor-mediul Sabouraud

11.Medii politrope de identificare biochimica a bacteriilor(TSI, MIU)-exemple.

-mediul TSI(agar triplu zaharat feros) evidentiaza fermentarea glucozei cu sau fara gaz, fermentarea lactozei si zaharozei si producerea de hidrogen sulfurat.

-mediul MIU(mobilitate, indol, uree) este semisolid si evidentiaza mobilitatea germenilor, producerea de ureaza; pentru evidentierea producerii de indol se ataseaza o banda indicatoare.

12.Morfologia unui bacteriofag

-dimensiuni-1-10μm

-forma si asezarea:

-cocii-diametru 0,8-1μm

-forma-rotunde(stafilococ), ovalare(enterococi), lanceolate, reniforme

-asezare-in gramezi sub forma de ciorchini de strugure(Staphylococcus)

-in tetrade, coci dispusi simetric cate 4

-in grupuri de cate 8 coci orientati in spatiu tridimensional

-"in diplo"

-in lanturi(Streptococcus)

-izolati(micrococii)

-bacilii-sunt bacterii cu forma de bastonase, cu dimensiuni intre 1,5-10μm

-asezarea poate fi cel mai des sub forma izolata, dar si in pozitii intamplatoare unul

fata de celalalt

-pot fi grupati-cate doi(Klebsiella pneumoniae)

-asezati in lanturi(streptobacili, bacilul antrax)

-sub forma literelor chinezesti(bacili difterici)

-cocobacilii-sunt bacterii cu forma intermediara intre coci si bacili, cu dimensiuni 1-1,5

μm(Bordetella pertussis, Haemophilus influenzae)

-vibrionii-sunt bacterii incurbate in forma de virgula(Vibrio cholerae)

-spirilii-sunt bacterii cu corpul spiralat cu filamentul mai scurt si cateva spire(Borrelia

recurrentis)

-spirochete-sunt bacterii cu filamentul mai lung, corpul flexibil cu 15-20 de spire

stranse si regulate(Treponema pallidum)

13.Antibiograma-metode, importanta in practica medicala.

Este testarea sensibilitatii unei tulpini bacteriene la agenti chimioterapici sau antibiotice. Principiul metodei consta in punerea in contact a suspensiei bacteriene cu diferite antibiotice.

a)      Metoda difuzimetrica-gradientul de concentratie necesar determinarii se realizeaza in mediu agarizat prin difuzarea radiala a antibioticului dintr-un depozit depus pe suprafata mediului, insamantata "in panza" cu bacteria de testat. Acest gradient scade proportional cu patratul distantei de la antibiotic. Cultura nu apare in aria in care antibioticul realizeaza CMI pentru bacteria testata. Metoda difuzimetrica se utilizeaza numai pentru bacteriile cu crestere rapida. Permite testarea mai multor antibiotice pe aceeasi flora.

b)      Metoda dilutiilor permite determinarea concentratiei minime inhibitorii(CMI). In mediul lichid, inoculul bacterian se distribuie intr-o serie de tuburi sau godeuri, continand bulion Mueller-Hinton cu antibioticul in concentratii crescande(0; 0,25; 1; 2; 4; 8; 16 mg/l). Inoculul consta dintr-o suspensie din tulpina microbiana de testat diluata de ordinul 10⁵germeni/ml. Dupa incubare 24 de ore la 37^oC, CMI este indicata de tubul sau godeul care contine cea mai mica concentratie de antibiotic la care cresterea bacteriana nu mai este vizibila.

14.Criterii de clasificare a chimioterapicelor antibacteriene-exemple.

a)Dupa structura chimica:

-beta-lactamine -peniciline: penicilina G, penicilina V, penicilina de depozit(moldamin),

ampicilina, oxacilina, cloxacilina, carbenicilina, amoxicilina,

carboxipeniciline, ticarcilina, imipenem.

-cefalosporine- I-a generatie:cefalexin, cefalothin, cefapirin, cefadroxil, cefazolin

-a II-a generatie:cefuroxim, cefonicid, ceforamid, cefoxitin,

cefotetan, cefotiam, cefamandol

-a III-a generatie:cefotaxim, ceftazidim, ceftriaxon, cefoperazon,

moxalactam

-a IV-a generatie:cefepima, carbacefema

-carbapenemi

-monobactami

-inhibitori de beta-lactamaza

-aminoglicoside: streptomicina, Kanamicina, Gentamicina, Neomicina, Spectinomicina.

-polimixine: polimixina B, polimixina E.

-alte antibiotibe: cloramfenicol, tetracicline, macrolide, lincomicina, clindamicina, novobiocina,

vancomicina, rifampicina

-chimioterapice antibacteriene considerate "non-antibiotice": sulfamide, biseptol, acid nalidixic,

nitrofurantoin, tiosemicarbazona, isoniazida, acid paraaminosalicilic

b)Dupa origine

-anibiotice propriu-zise(chimioterapice naturale) produse de microorganisme: penicilina,

polimixina, bacitracina, streptomicina.

-chimioterapice de semisinteza- prezenti in laborator pe baza unui nucleu sintetizat de catre un microorganism viu: meticilina, penicilina V, G, ampicilina.

-produsi de sinteza chimica integrala(chimioterapice sintetice): sulfamidele, acid nalidixic, biseptol, HIN, PAS, nitrofurantoin.

c)Dupa scopul folosirii

Chimioterapice: antibacteriene, antifungice, antiparazitare, antivirale.

d)Dupa spectrul de activitate

-chimioterapice cu spectru larg: cloramfenicol, tetraciclinele, ampicilina, sulfamidele,

cefalosporinele.

-chimioterapice cu spectru ingust-cu actiune predominanta asupra bacteriilor Gram pozitive

(majoritatea penicilinelor, eritromicina, streptomicina).

-cu actiune predominanta asupra unor bacterii Gram negative

(kanamicina, gentamicina, cefalosporine, acidul nalidixic).

-cu actiune predominanta asupra BK (streptomicina, HIN, PAS).

-cu actiune predominanta asupra spirochetelor (penicilina).

e)Dupa felul in care isi exercita efectul antibacterian

-bacteriostatice- impiedica multiplicarea germenilor bacterieni, fara sa-i omoare (cloramfenicol,

sulfamide, tetraciclina)

-bactericide-au efect letal asupra celulelor bacteriene (streptomicina, penicilina, ampicilina)

f)Dupa mecanismul de actiune

-agenti cu actiune asupra structurilor de suprafata ale celulei bacteriene (perete celular, membrana citoplasmatica)

-agenti care interfera cu sinteza proteinelor celulelor bacteriene

-agenti care interfera cu sinteza acizilor nucleici

15.Patogenitatea bacteriilor prin factori de virulenta corpusculari-exemple.

Patogenitatea reprezinta capacitatea bacteriei de a produce boala prin virulenta si/sau toxinogeneza.

Virulenta este proprietatea unor agenti microbieni de a patrunde in organismul gazdei, de

a-l invada, de a se multiplica si de a produce leziuni sau modificari functionale ale tesuturilor pentru care prezinta tropism.

Factorii de virulenta corpusculari sunt reprezentati de anumite elemente din structura celulei bacteriene, care ii confera protectie impotriva mijloacelor de aparare ale organismului, dar si posibilitatea de a patrunde in tesuturi:

-capsula

-componente ale peretelui celular

-mobilitatea

-fimbrii

-adezine nefimbriale

16.Patogenitatea bacteriilor prin factori de virulenta enzimatici-exemple.

Enzimele sunt factori favorizanti ai patrunderii germenilor dincolo de poarta de intrare.

-colagenaza

-hialuronidaza

-fibrinolizine

-coagulaza

-lecitinaza

-hemolizinele si leucocidinele

17.Patogenitatea bacteriilor prin toxinogeneza-exemple.

Toxinogeneza reprezinta capacitatea unor bacterii de a produce toxine. Toxinele sunt de doua feluri:

-exotoxine, secretate in mediul inconjurator ca un proces al metabolismului propriu

bacterian

-endotoxine care fac parte din structura peretelui celular si care sunt eliberate in mediu

numai dupa moartea bacteriei

18.Postulatele lui Robert Koch-enumerare.

Definitia unui patogen:

1.Organismul trebuie sa fie gasit in leziunea unei boli;

2.Organismul trebuie sa fie izolat de la gazda infectata si crescut intr-o cultura pura;

3.Inocularea organismului pur intr-o alta gazda ar trebui sa initieze boala;

4.Organismul trebuie sa fie recuperat din nou de la a doua gazda.

19.Anticorpi cu rol in apararea antibacteriana-exemple.

-IgG

-anticorpi antitoxici

-IgA

-IgM

20.Celule implicate in apararea nespecifica si specifica antibacteriana.

-limfocitele T_helper

-limfocite T imune

21.Vaccinuri bacteriene-clasificare, exemple.

a)Dupa tipurile de preparate vaccinale

-vaccinuri corpusculare-cu germeni bacterieni omorati(vaccinul tifoidic, holeric, pertussis)

-cu germeni bacterieni vii atenuati(vaccinul BCG, vaccinul viu atenuat,

vaccinul difteric T₃₂ viu)

-vaccinuri subunitare-vaccinul pertussis acelular, vaccinul acelular contra difteriei, tetanosului si tusei convulsive

-anatoxine-vaccinul difteric absorbit (VDA-IC)

b)Dupa numarul componentelor antigenice

-monovaccinuri-vaccinul monovalent alcatuit din vaccin holeric, anatoxina tetanica

-vaccinuri asociate(mixte)-bivaccinul diftero-tetanic, trivaccinul diftero-tetano-pertussis.

Bacteriologie speciala

1. Stafilococ: caractere morfologice

Este coc Gram pozitiv, sferic, cu diametrul cuprins intre 0,5-1,2 μm. Se grupeaza sub forma de gramezi, asemanator boabelor din ciorchinele de strugure. Este nesporulat, imobil si uzual necapsulat, existand si forme capsulate la tulpinile virulente.

2. Stafilococ: caractere de cultura

Sunt germeni nepretentiosi din punct de vedere metabolic, putand creste pe medii simple lichide si solide la un pH optim de 7,5 si temperatura 36-37^oC, in conditii de aerobioza sau anaerobioza.

Cresterea in mediu lichid (bulion simplu) duce la tulburarea uniforma a acestuia, cu depozit moderat la baza tubului insamantat. Pe mediu solid, dupa incubare timp de 18-24 ore la 37^oC, dezvolta colonii cu aspect "S", rotunde, cu diametru cuprins intre 1-3 mm, lucioase, bombate, opace, cu margini perfecte, pigmentate in auriu.

Daca stafilococul poseda capsula, colonia va avea aspect mucos, filant. In cazul izolarii pe mediu agar-sange, colonia este inconjurata de o zona de hemoliza totala.

3. Stafilococ: aspecte clinice in infectii umane

Se caracterizeaza printr-un polimorfism, atat in ceea ce priveste varietatea organelor si tesuturilor interesate, cat si prin intensitatea fenomenelor clinice, care pot fi usoare, dar si severe.

Localizarile cutanate ale infectiei se manifesta prin dermatoza, acnee, furuncule localizate pe ceafa, fese, panaritii, ulcior, infectie a glandelor sudoripare, infectii ale plagilor.

Localizarile mucoase se manifesta clinic prin: flegmon amigdaloidian, rinita purulenta la nou-nascuti, conjunctivite, angine, sinuzite, otite, mastoidite.

Localizarile viscerale ale infectiei stafilococice au diverse manifestari: pneumonie, abces pulmonar, pleurezie purulenta, endocardite, pericardite, flebite, osteomielita, artrita, meningite, accidente vasculare, tromboflebite, uretrite, cistite, prostatite, metro-anexite, sindromul socului toxic, abces renal, intoxicatie alimentara, enterocolita pseudomembranoasa.

4. Stafilococ: schema diagnosticului de laborator

a)Recoltarea produselor patologice se fac in conditii de stricta asepsie prin metode ce depind de produsele patologice.

b)Diagnosticul bacteriologic

Examenul direct-se efectueaza prin frotiuri colorate Gram si albastru de metilen. Pune in evidenta coci Gram pozitivi asezati in ciorchine, necapsulati, eventual prezenta unei alte flore de asociatie si a granulocitelor, precum si relatia de fagocitoza dintre fagocite si germeni.

Izolarea-se face prin insamantarea pe medii simple(geloza, bulion), pe medii complexe(geloza-sange) si pe medii hiperclorurate sau solide. Mediile hiperclorurate au scopul de a selecta stafilococii dintr.un produs normal contaminat. Stafilococul este un germen aerob, facultativ anaerob.

Identificarea

-caractere de cultura- pe mediile solide produc colonii "S", bombate, lucioase, cu margini regualte, pigmentate. Pe mediul cu geloza-sange speciile patogene produc o hemoliza totala, clara, de tip cald-rece. Pe mediile lichide tulbura uniform bulionul.

-caractere morfologice- examenul microscopic al frotiurilor efectuate din coloniile de stafilococ, colorate Gram pune in evidenta coci Gram pozitivi asezati in gramezi, necapsulati.

-caracter de patogenitate- pentru stabilirea proprietatilor patogenice se fac cu urmatoarele teste:

1.Teste de patogenitate "in vitro"

Testul hemolizei- tulpinile patogene determina in jurul coloniilor o zona caracteristica de hemoliza. Este completa si incompleta.

Testul coagulazei-cercetarea prezentei coagulazei se poate efectua in tuburi de hemoliza sau pe lama, dupa cum se cerceteaza forma libera sau legata a enzimei. Cercetarea coagulazei libere se pune intr-o eprubeta cu 1 ml plasma de om sau iepure, diluata 1/5, iar in ea se suspenda 1-2 picaturi din cultura de bulion de 24 ore a tulpinii in cauza. Eprubeta se mentine la 37^oc si este urmarit procesul lent de coagulare din 30 in 30 minute timp de 4-6 ore, agitandu-se lent eprubeta. Cercetarea coagulazei legate se face pe lama depunandu-se o picatura de plasma umana in care emulsionam o colonie din tulpina de cercetat. Coagulaza determina adunarea in gramezi a stafilococilor, vizibile ca niste fire de nisip.

Frementarea manitei-tulpinile de stafilococ scindeaza in conditii de aerobioza manitolul inclus in mediul de cultura. Coloniile de stafilococ care fermenteaza manita se coloreaza in galben-portocaliu cu un halou galben.

Pigmentogeneza-pentru a cerceta capacitatea de a produce pigment a tulpinilor de stafilococ izolate pe mediile de cultura, acestea se insamanteaza pe geloza-sange sau pe un mediu cu ser de bou. Dupa o incubare de 20-24 ore se mentin 24-48 ore la temperatura camerei, la care randamentul productiei de pigment este crescut.

Testul fibrinolizinei-elaborarea de fibrinolizina se pune in evidenta prin insamantarea unor colonii de stafilococi in arii mici pe un mediu geloza cu plasma oxalatata. In cazul unei reactiipozitive apare o zona calra.

2. Teste de patogenitate "in vivo"

Filtratul unei culturi de stafilococ in bulion inoculat in cantitate de 0,1-0,2 ml intradermic la iepure produce in zilele urmatoare o dermonecroza. Daca se inoculeaza intravenos la iepure in cantitate de 0,5 ml animalul va muri.

-identificarea pe baza sensibilitatii la bacteriofagi-lizotipia testeaza sensibilitatea la bacteriofagi

c)Antibiograma-se efectueaza antibiograma difuzimetrica obligatorie, deoarece tulpinile de stafilococ capata repede rezistenta la chimioterapice ca urmare a tratamentului necorespunzator cu antibiotice ca doza si ca timp.

5. Streptococ beta-hemolitic grup A: caractere morfologice

Streptococii beta-hemolitici sunt coci sferici(diametru 1μm), Gram pozitivi, asezati in lanturi, nesporulati, imobili, rareori capsulati. Sub actiunea antibioticelor pot suferi modificari morfologice si tinctoriale.

6. Streptococ beta-hemolitic grup A: caractere de cultura

Pentru dezvoltare necesita suplimentarea mediilor de cultura cu ser sau sange integral, la pH=7,5 si T=37^oC; sunt aerobi sau facultativ anaerobi. Pe medii lichide produce depozit la fundul eprubetei si pe pereti. Pe mediile solide produc colonii mici, translucide, inconjurate de o zona de hemoliza beta . Dupa aspectul coloniilor pe geloza-sange se disting :

-colonii "mucoide"-lucioase, mici, filante

-colonii "mott"-mici, cu suprafata mamelonata si cu margini neregulate, cu consistenta apoasa

-colonii "glossy"-lucioase, convexe, stralucitoare

-colonii "rough"-colonii pitice, turite, uscate, rugoase, nepatogene

7. Streptococ beta-hemolitic grup A: aspecte clinice in infectiile umane

Streptococii beta-hemolitici, prin complexitatea componentelor celulare pot sa determine numeroase forme de imbolnaviri.

In raport de: calea de patrundere, localizare, patogenitatea germenului si rezistenta organismului, streptococii piogeni pot determina infectii acute cu localizate la nivelul tractului respirator, pielii, tractului genital etc.

a)Infectii acute

infectii respiratorii-faringita, angine, otite, sinuzite, mastoidite, bronhopneumonii, pleurezii, pneumopatii

infectii cutanate-impetigo, infectia comisurii bucale, infectia interdigitala, erizipetul, suprainfectia plagilor chirurgicale sau a arsurilor

infectii genitale

scarlatina

b)Complicatii poststreptococice

glomerulonefrita acuta difuza, reumatismul articular acut, febra reumatismala, cardita reumatismala, coreea, eritemul nodos

8. Streptococ beta-hemolitic grup A: schema diagnosticului de laborator

a)Recoltarea produselor patologice: exudatul faringian, sputa, puroi, lichide de punctie, sange.

b)Diagnosticul microbiologic

Diagnosticul bacteriologic

Examenul direct- se efectueaza pe frotiuri colorate Gram si albastru de metilen avand rol de orientare in cazul produselor normal contaminate cu flora saprofita. Prin examenul microscopic se observa coci Gram pozitivi, sferici, dispusi in lanturi scurte, nesporulati si necapsulati.

Izolarea se afce pe medii complexe geloza-sange, bulion ser sau lichid de ascita.

Identificarea tulpinilor streptococice se face avandu-se in vedere urmatoarele caractere:

1) Caractere de cultura

1.1)Pe medii solide-streptococul beta-hemolitic pe geloza sange, dupa 18 ore de incubare la 37^oC se dezvolta sub forma unor coloniimici, punctiforme de tip "S", translucide inconjurate de o zona de hemoliza beta. Tulpinile capsulate formeaza colonii mucoide, rotunde, lucioase. Se mai pot diferentia colonii matt apoase, colonii "glossy", colonii R.

1.2)Pe medii lichide germenii se dezvolta manifestand o crestere granulara sub forma de grunji care se depun la fundul si pe peretii eprubetei, lasand supernatantul limpede.

2)Caractere morfologice-pentru a stabili caracterele morfologice, din cultura pura se face un frotiu colorat Gram. Pe frotiu streptococii beta hemolitici se prezinta sub forma de celule sferice Gram pozitivi, asezate caracteristic in lanturi lungi asemanatoare unui sirag de margele.

3)Identificarea serologica de grup si tip

3.1)Identificarea grupului serologic se poate realiza prin mai multe metode:

-testul sensibilitatii la bacitracina-reprezinta o metoda de diferentiere rapida a streptococilor beta hemolitici de grup A de testul streptococilor beta hemolitici din grupele C si G.

-reactii serologice de certitudine-urmaresc identificarea grupului streptococic:

a)      Reactia de prercipitare in inel- consta in punerea in contact a doi reactanti, antigenul C de grup si anticorpii din serurile precipitante de grup A, C, G.

b)      Metoda coaglutinarii se efectueaza pe lama utilizand suspensia tulpinii de identificat si reactivi streptici A, B, C, G, D

c)      Tehnica imunofluorescentei-foloseste seruri imune standard fluorescente specifice

d)      Tehnica latex aglutinarii in care anticorpii specifici de grup sunt fixati pe latex

3.2)Identificarea tipului se efectueaza in cadrul anchetelor epidemiologice pentru a contribuii la stabilirea surselor epidemiologice si filatiei cazurilor. Se folosesc:

-reactia de aglutinare pentru evidentierea antigenului T

-reactia de precipitare pentru evidentierea antigenului M

Sensibilitatea la chimioterapice- numai cei din grupul A si-au pastrat sensibilitatea la penicilina si eritromicina.

Diagnosticul imunobiologic

Diagnosticul serologic urmareste evidentierea anticorpilor antistreptococici fata de antigenele microbiene si fata de toxinele streptococice.

Evidentierea anticorpilor antimicrobieni se realizeaza prin reactii de aglutinare si precipitare. Prezenta anticorpilor antiproteina M denota o imunitate de protectie fata de infectia streptococica.

Evidentierea anticorpilor antitoxici se poate realiza "in vitro" sau "in vivo"

2.1) "In vitro" anticorpii antitoxici frecvent decelerati in diagnosticul afectiunilor

streptococice sunt:

-anticorpii antistreptococici-O(ASLO) este o reactie de neutralizare a streptolizinei O

de catre anticorpii specifici prezenti in serul bolnavului. Neutralizarea activitatii

hemolitice a streptolizinei se evidentiaza macroscopic prin adaugarea de hematii de

iepure. In prezenta anticorpilor hematiile raman nehemolizate si se depun la fundul

eprubetei de reactie. Titrul anticorpilor este dat de ultimul tub in care nu se mai

produce hemoliza. Titrul normal este pana la 250 unitati ASLO/ml. Rezultatele

pozitive indica existenta unei infectii streptococice acute a complicatiilor post-

streptococice sau ineficienta tratamentului.

2.2) "In vivo" se poate realiza prin reactii de neutralizare:

-IDR dick testeaza prezenta sau absenta anticorpilor antitoxina eritrogena in

organismul uman

-fenomenul de stingere Schultz-Charlton identifica eruptia cutanata data de

streptococi betahemolitici grup A

Testarea raspunsului imun celular se efectueaza :

-"in vitro"-testul transformarii blastice fata de antigene streptococice

-testul de inhibitie a migrarii macrofagelor

-"in vivo"-depistarea starii de hipersensibilitate la subiectii cu infectii repetate prin

intradermoreactii la vaccin streptococic sau streptolizina "O". In ambele

cazuri reactia pozitiva consta in aparitia dupa 24 de ore de la inoculare

a unui eritem.

9. Bacilul Koch : caractere morfologice

Se poate evidentia la microscopul optic dupa colorarea preparatului cu metoda Ziehl-Neelsen. Prezinta alcool-acido rezistenta. In prezenta fuxinei concentrate si la cald, lipidele din peretele celular formeaza complexe cu acest colorant, ceea ce face ca bacilii sa se coloreze in rosu. Sunt subtiri, rectilinii, asezati izolati sau sub forma literelor X, Y, V, Z, K, sunt imobili, nesporulati, necapsulati. In cazul in care frotiul provine dintr-un produs patologic, se mai pot evidentia ca elemente de asociatie flora bacteriana, celule de descuamare, leucocite, colorate in albastru, datorita faptului ca au pierdut fuxina dupa tratamentul preparatului cu alcool-acid. Daca preparatul microscopic este efectuat din cultura de pe mediul de izolare(Lowenstein), bacilii Koch se vor dispune in cordoane rasucite, reprezentand un semn de patogenitate a tulpinii. Examenul microscopic se mai face si cu ajutorul reactiei de imunofluorescenta.

10. Bacilul Koch : caractere de cultura

Este strict aerob, pretentios din punct de vedere metabolic. Creste pe mediul Lowenstein-Jensen(galbenus de ou, acid glutamic, glicerina, amidon, asparagina, extracte de tesuturi) dupa 2-3 saptamani in conditii de aerobioza. Coloniile sunt rugoase, cu suprafata si marginile neregulate, cu aspect conopidiform, de culoare alb-galbuie. Pe mediul lichid imbogatit cu substante organice, BK formeaza o pelicula care se ingroasa treptat si cade la fundul eprubetei.

11. Bacilul Koch : aspecte clinice in tuberculoza

Aparitia infectiei tuberculoase depinde atat de virulenta tulpinii, cat si de reactivitatea nespecifica si specifica a organismului. Boala la om are consecinta inhalarii sau ingestiei de bacili tuberculosi. Primoinfectia tuberculoasa se produce de obicei la persoanele tuberculino-negative, in primii ani de viata. Localizarea este preponderent pulmonara. Complexul primar este format din:

-afectul primar(folicul de celule epiteloide si gigante)

-limfagita

-adenopatie(inflamatia si hipertrofia ganglionilor regionali)

Leziunile pot evolua catre stabilizare si scleroza. Daca multiplicarea bacililor este mai mare se poate antrena o necroza cu producerea de cazeum. Poate surveni o evolutie nefavorabila prin ramolirea zonei cazeificate cu formarea unei "caverne" care poate erupe intr-o bronhie, cu diseminare in restul plamanului si formarea de noi focare. In cazul eruptiei intr-un vas sanguin germenii trec in circulatie, cu localizari extrapulmonare (intestinale, genitale, renale, meningeale, osoase, cutanate, seroase).

12. Bacilul Koch : schema diagnosticului de laborator

a)Recoltarea produselor patologice:sputa, spalatura gastrica, bronsica, exudat pleural, LCR, urina, probe de biopsie.

b)Diagnosticul microbiologic

Examenul direct se face pe frotiu colorat Ziehl-Neelsen, depisteaza bacilii acido-alcoolo rezistenti fara indicatii referitoare la specie.

-Tehnica coloratiei Ziehl-Neelsen pune in evidenta forma tipica, bacilii incubati, de

culoare rosie pe fondul albastru al preparatului. Examinarea se face cu obiectivul cu

imersie. Se examineaza minim 100 de campuri. Trebuie avute in vedere posibile erori.

-Tehnica examinarii prin fluorescenta se utilizeaza un amestec de auramina-rhodamina. Se

considera rezultat negativ daca nu se evidentiaza niciun bacil alcoolo-acido-rezistent si

rezultat cert pozitiv daca se evidentiaza 1-5 bacili.

-Reactia PCR pune in evidenta ADN-ul mycobacteriei in LCR in cazul efectuarii unui

diagnostic rapid al meningitei tuberculoase.

Izolarea - prelevatele contaminate se insamanteaza dupa decontaminare. Pentru izolare se folosesc medii imbogatite Lowenstein-Jensen.

Identificarea

-pe baza caracterelor de cultura

-caractere morfologice

-pe baza caracterelor biochimice

-Testul catalazei consta in acoperirea coloniilor obtinute pe mediile solide cu o solutie de

perhidrol. Reactia pozitiva consta in aparitia unor bule de gaz.

-Testul lui Konno-punerea in contact a unei culturi de bacili vii cu o solutie(anilin,

alcool, bromura de cialogen). In caz pozitiv tulpina niacino-pozitiva apare de culoare

galbena.

-pe baza caracterelor de patogenitate-se inoculeaza 2 cobai pe cale subcutanata. Se observa

dupa 2 saptamani modificarea starii generale. La locul de inoculare apare un nodul fluctuent

care ulcereaza. Dupa moartea animalului la autopsie se constata hepatosplienomegalie.

-lizotipia este importanta din punct de vedere epidemiologic, evidentiind circulatia

mycobacteriilor patogene intre diferite zone geografice

Antibiograma-testarea se face pe mediul Lowenstein-Jensen, dilutiile de antibiotic se

adauga pe suprafata mediului. Pentru streptomicina si PAS se folosesc serii de tuburi dintre

care 2 sunt martori.

c)Diagnostic imunobiologic

-"in vivo" prin intradermoreactia la tuberculina

-"in vitro" prin testul de transformare blastica specifica limfocitelor "T"

-imunitatea umorala se studiaza in ser a anticorpilor IgA specifici si a anticorpilor IgG

fata de fractiunile antigenice A₆₀ si 38KD folosind tehnici imunoenzimatice.

13. Pneumococ : caractere morfologice

Coci Gram pozitivi, in forma de "flacara de lumanare" sau "varf de lance". De obicei, in produsul patologic se gasesc grupati cate doi indivizi, cu predominanta extracelulara. In cultura, sunt asezati tot in perechi sau in lanturi scurte, mai ales cand concentratia ionilor de magneziu este scazuta. Prezinta capsula sub forma de halou luminos in jurul germenilor cu coloratia albastru de metilen sau tus de China, de natura polizaharidica. Sunt imobili, nesporulati.

14. Gonococ : caractere morfologice

Coci Gram negativi, reniformi, asezati "in diplo", predominant intracelular. Ca structura, tipurile 1 si 2(virulente) prezinta fimbrii, iar tipurile 3 si 4(avirulente) nu prezinta fimbrii. Fimbriile se evidentiaza cu microscopul electronic si sunt atributul germenilor virulenti.

Virusologia generala

1. Morfologie si simetrie virala -exemple.

Virusuri animale

Forma virusurilor:

• Cilindrica-unele virusuri vegetale de tipul virusului mozaicului tutunului
• Sferoidala-virusuri gripale
• Cristaliforma(poliedrica)-enterovirusurile
• Prisma sau caramida-poxvirusurile

Structura virala:

Virionul(particula virala) este alcatuit din miez genomic,capsida si uneori anvelopa.

a)      Miezul genomic-alcatuit din ADN sau ARN cu structura polinucleotidica. Contine informatia necesara pentru multiplicarea virala.Genomul poate fi simplu sau dublu, spiralat, linear, circular sau suprainfasurat. Genomul poate fi simplu sau dublu, continuu sau fragmentat.

b) Capsida-invelisul extern al genomului viral, pe care il protejaza. Este formata din subunitati identice numite capsomere. Din punct de vedere structural acestea sunt alcatuite din proteine simple, hetero-proteine sau glicoproteine virale. Genomul viral impreuna cu capsida formeaza nucleocapsida.

c)      Invelisul(peplos,manta,anvelopa) este alcatuit din subunitati denumite peplomere de natura proteica. Este prezent la unele virusuri: HIV,virusul gripal.

Tipuri de simetrie virala:

Capsomerele se pot aseza spatial in 3 modele de simetrie virala:

Simetrie helicoidala-virusul mozaicului tutunului,virusurile gripale,virusul rabic

Simetrie icosaedrica(cubica)-enterovirusuri,adenovirusuri,herpesvirusuri

Simetrie mixta-poxvirusuri

Virusuri bacteriene(bacteriofagi)

Prezinta:

a)      cap-format din miez de ADN sau ARN

b)      gat

c)      coada-formata din-miezul lacunar

-teaca contractila

-placa bazala

2. Schema diagnosticului de laborator in viroze.
1. Recoltarea si prelucrarea produselor patologice

Eficienta examenului depinde de:

-momentul prelevarii produselor

-locul de unde se recolteaza-in general pentru viroze-secretii nazo-faringiene,oculare sau in secretia conjunctivala

-modul de prelevare-punctie-sange,LCR

-tampon-secretii conjunctivale, nazale, faringiene, vaginale

-eliminare directa-fecale, urina, sputa

-post-mortem se recolteaza fragmente de organe

Dupa prelevare, produsele patologice sunt conservate si transportate in medii de cultura cu antibiotice Penicilina, Streptomicina pentru inhibarea dezvoltarii florei microbiene. Prelucrarea produselor cu densitate mare se face cu ajutorul mediului conservant IC₆₅ si dupa centrifugare 30 de minute la 5000 turatii/minut, se va retine supernatantul.

Izolarea virusului se face pentru identificarea virusului si stabilirea etiologiei virale a infectiei.

a) izolarea virusului pe culturi celulare: culturile celulare reprezinta suspensii din eucariote cultivate "in vitro" in conditii adecvate de nutritie, temperatura, pH. Mediile contin: ioni minerali, vitamine, aminoacizi, indicator de pH iar pentru stimularea cresterii se adauga ser de vitel.

Culturile celulare se clasifica in:

-culturi primare din tesuturi adulte normale(cultura primara de rinichi de maimuta sau rinichi de iepure)

-linii celulare continue sau tumorale-linia Hella

-tulpinile diploide-sursa un tesut embrionar.

Efecte virus specifice in cultura celulara:

efect citopatic (ECP) se manifesta prin modificarile in urma multiplicarii unor virusuri citopatogenice. ECP se observa cu microscopul dupa culorare cu Giemsa sau cu hematoxilina. Enterovirusurile determina ECP distructiv:celule globuloase, refringente, alte virusuri determina formarea de celule gigante

Incluzii virale intracelulare

Efectul hemaglutinant: este produs de virusurile gripale, paragripale in prezenta hematiilor de cocos sau om grup "0"

Efectul hemoabsorbant(HAD)consta in atasarea hematiilor de la diverse specii animale la suprafata celulelor virus infectate

Efectul de interferenta - se utilizeaza pe virusuri ce nu determina efect citopatic

b)izolarea virusului pe oul embrionat (embrioni de 7-11 zile)constituie gazda pentru mixovirusuri, herpes virusuri. Inocularea se face intraamniotic, intraalantoidian, pe membrana corio-alantoidiana, intravitelin sau direct in embrion. Se inoculeaza 0,2 ml din produs prelucrat si se incubeaza la 35^o C timp de 2-5 zile. Prezenta virusului se recunoaste prin reducerea miscarilor pana la imobilizarea embrionului, la membre-hemoragii, ingrosarea si opacifierea lor, lichidele embrionare capata activitati proprii virusului(hemaglutinare).

c)izolarea pe animale de laborators :sunt folositi soarecii adulti, soareci nou-nascuti, dihori. Cai de inoculare subcutanata, intracerebrala, intranazala, intraperitoneala. Efectele sunt specifice-incluzii virale, paralizii, inducerea de tumori la animale imunosupresate.

Titrarea virusului izolat are ca scop evaluarea cantitativa a concentratiei particulelor virale infectate capabile sa produca virus specific la gazda sensibila. Se realizeaza dilutii binare sau logaritmice din virusul izolat. Exprimarea titrului se face in:

-doze citopatogene

-unitati hemaglutinante

-doze letale

Identificarea virusului izolat

Identificare orientativa si serologica prin reactii imune antigen-anticorp, ce utilizeaza seruri standard specifice livrate de Institutul Cantacuzino.

a) Reactia de imunofluorescenta - pentru identificarea serologica a unor virusuri din genul Herpes simplex, virusul rabic, virusuri gripale, paragripale.

Principiu:

Cultura celulara se trateaza cu ser imun standard specific virusului marcat cu o substanta fluorescenta(metoda directa)sau cu ser imun standard si ulterior cu ser antigamaglobulina speciei pe care s-a obtinut serul de referinta fluorocromat(metoda indirecta). La reactia pozitiva se produce fixarea anticorpilor specifici pe cultura celulara virus infectata,observandu-se o fluorescenta intensa a celulelor in lumina ultravioleta.

b) Reactia de neutralizare

Principiu:

Punerea in contact a virusului izolat cu un ser imun standard si inocularea amestecului la gazde sensibile are ca rezultat, in cazul reactiei pozitive absenta efectului virus specific. Se foloseste la identificarea serologica a enterovirusurilor, arbovirusurilor, virusurilor din grupul Herpes.

c) Reactia de inhibare a neutralizarii

Principiu:

In prezenta serului imun specific, efectul hemaglutinant nu se mai produce.

d) Reactia de inhibare a hemadsorbtiei

Principiu:

In urma unirii dintre virusurile hemadsorbante si serul imun standard virusurile nu-si mai pot exercita efectul hemadsorbant al eritrocitelor la suprafata celulelor virus infectate.

e) Reactia de fixare a complementului

Principiu:

In prezenta virusului necunoscut(antigen) si a anticorpilor specifici, se realizeaza complexul

antigen-anticorp pe care se fixeaza complementul(alexina), iar sistemul hemolitic indicator ramane integru(absenta hemolizei).

f) Reactia de dubla imunodifuzie in gel

Principiu:

In urma migrarii in gel a celor doi reactanti imuni(antigenul viral de identificat si serul imun standard specific) se formeaza complexul antigen-anticorp, care se vizualizeaza prin aparitia in gel a unei linii de precipitare.

g) ELISA

Se bazeaza pe reactia imuna antigen-anticorp in care elementul cunoscut(anticorpii specifici fata de antigenul necunoscut din proba de analizat) este fixat pe suport denumit imunosorbent, iar un element al reactiei, conjugatul este cuplat cu o enzima. In cazul reactiei pozitive se formeaza complexe imune antigen-anticorp pe care se vor fixa anticorpii specifici din conjugat. Enzima va deveni activa si se va modifica culoarea.

h)RIA
Principiu:

RIA este o metoda simpla, precisa, specifica si sensibila care permite evidentierea tipurilor de antigene si evaluarea cantitativa a acestora. Antigenul de testat si antigenul standard marcat radioactiv intra in concurenta fata de celalalt. Concentratia antigenului de testat prezent in esantionul biologic studiat se determina prin masurarea radioactivitatii. Nivelul radioactivitatii este invers proportional cu cantitatea de antigen nemarcat introdus in reactie.

Diagnosticul imunobiologic in viroze

Presupune testarea radioactiviatii imune atat pe linie umorala cat si celulara a individului infectat viral.

a)      Diagnosticul serologic(testarea reactivitatii imune umorale)

In cursul infectiilor virale, in sangele bolnavilor apar anticorpi specifici fata de diferitele structuri antigenice ale virusului gazda, detectarea si identificarea acestora constituie diagnosticul serologic. Reactiile serologice pentru decelerarea anticorpilor antivirali sunt antigen-anticorp, in care elementul cunoscut este titrul seric in anticorpi, iar elementul cunoscut e reprezentat de tulpinile standard de virusuri.

Reactiile folosite sunt:

Reactia de seroneutralizare

Amestecurile intre dilutii binare din serul de testat si antigenul viral standard se incubeaza o perioada de timp dupa care se inoculeaza la gazda sensibila. Reactia pozitiva consta in absenta efectului virus specific asupra gazdei. Titrul seroneutralizant al serului este dat de dilutia cea mai mare de ser de bolnav care, in amestec cu virusul standard, impiedica aparitia efectului virus specific.

Reactia de inhibare a neutralizarii

Dilutii binare din serul de cercetat se pun in contact cu o concentratie bine stabilita de antigen viral standard si dupa o perioada de incubare se adauga o suspensie eritrocitara proaspata. Interpretarea reactiei se bazeaza pe aflarea dilutiei maxime de ser capabila sa impiedice hemaglutinarea virala.

Reactia de fixare a complementului

Are 2 etape:

In I etapa se formeaza complexul antigen-anticorp cu fixarea la complement. In a II-a etapa se poate observa fenomenul cu ajutorul hematiilor sensibilizate cu anticorpi corespunzatori=sistem hemolitic.

Daca s-a format complexul antigen-anticorp nu sunt afectate hematiile; daca lipsesc anticorpii specifici antigenului in serul de testat, complementul se va fixa pe hematiile sensibilizate, declansand liza acestora.

RFC poate fi - calitativa - BORDET-WASSERMAN

- cantitativa - IDA-BENGSTON

Titrul alexinei (1 unitate de alexina) se stabileste printr-o reactie de titrare in prezenta sistemului hemolitic. In diagnosticul serologic al virozelor se folosesc 3 unitati de alexina.

Reactia de hemaglutinare pasiva (HAP)

In prezenta anticorpilor specifici si a antigenului viral standard (adsorbit anterior pe eritrocite penetrate cu tanin) se produce aglutinarea eritrocitelor (reactie pozitiva). Titrul serului este reprezentat de dilutia cea mai inalta la care se produce hemaglutinarea completa.

Reactia de imunofluorescenta

In diagnosticul serologic se foloseste metoda indirecta. Are 2 timpi:

-in primul rand preparatul care contine antigenul standard viral se trateaza cu ser de cercetat in care se cauta anticorpii specifici. In cazul reactiei pozitive se formeaza complexul antigen-anticorp nefluorescent.

-in timpul al doilea, preparatul se trateaza cu ser antiglobulinic fluorescent care in cazul reactiei pozitive apare la lumina ultravioleta.

ELISA

Reactie antigen-anticorp care foloseste antigene sau anticorpi marcati cu o enzima care actioneaza pe substrat si va da o reactie de culoare ce se va citi la spekol. Reactia e de doua tipuri:

-directa

-competitiva

b)      Testarea reactivitatii imune celulare

Intradermoreactia de tip tuberculinic

Se utilizeaza pentru depistarea unor stari de hipersensibilitate de tip intarziat induse de anumite virusuri

Limfocitele T, sensibilizate de anumiti antigeni virali, reactioneaza la al doilea contact cu acelasi antigen viral prin eliberarea unor mediatori imuni celulari(limfokine). Dupa administrarea intradermica a antigenului viral de testat, la un anumit interval de timp, in cazul reactiei pozitive se produc modificari la locul de inoculare.

Testul de transformare blastica limfocitara

Limfocitele sensibilizate puse in contact cu antigenul viral sensibilizat prolifereaza si se transforma in celule cu aspect limfoblastic.

Testul de citometrie imuna

Testul pune in evidenta eliberarea unei limfokine de catre celulele T efectorii, in contact cu "celula tinta" ca antigen. Celulele marcate cu Crom-51 sunt puse in contact cu limfocitele T de testat. Nivelul izotopului creste progresiv in cazul reactiei pozitive.

Testul de inhibitie a migrarii macrofagelor

Factorul inhibitor al migrarii macrofagelor face parte dintre mediatorii eliberati de catre limfocitele imune "in vivo" si "in vitro" in prezenta antigenului sensibilizat viral, in cursul imunitatii celulare mediate celular. Acest test apreciaza eliberarea de limfokine. Suspensia de celule obtinuta din sange este introdusa in tuburi capilare de sticla care dupa centrifugare unde se obtin fragmente de celule cu sticla se introduc in camere cu medii de crestere suplimentat cu ser fetal de vitel. Se incubeaza. La martori se va constata o "coroana" de macrofage la capatul tubului. Daca testul e pozitiv "coroana "e mica sau lipseste.

Testul de rozetare

Permit stabilirea procentuala a populatiilor limfocitare in functie de diferiti determinanti antigenici. Metoda uzuala consta in centrifugarea sangelui in gradient cu Ficoll-Odiston. Determinarea populatiei de limfocite T totale periferice se face prin testul de rozetare E de mica afinitate. Testul de rozetare E de mare afinitate stabileste proportia de limfocite T_helper.

Metoda citometriei de flux

Anticorpii monoclonari obtinuti "in vitro" cuplati cu o substanta fluorescenta se unesc cu antigenele de membrana specifica cunoscute sub denumirea de CD.

3. Izolarea virusurilor pe gazde sensibile

Izolarea virusului se face pentru identificarea si stabilirea etiologiei virale a infectiei.

a) izolarea virusului pe culturi celulare:culturile celulare reprezinta suspensii din eucariote cultivate "in vitro" in conditii adecvate de nutritie, temperatura, pH. Mediile contin: ioni minerali, vitamine, aminoacizi, indicator de pH iar pentru stimularea cresterii se adauga ser de vitel

Culturile celulare se clasifica in:

-culturi primare din tesuturi adulte normale (cultura primara de rinichi de maimuta sau rinichi de iepure)

-linii celulare continue sau tumorale - linia Hella

-tulpinile diploide - sursa un tesut embrionar.

b) izolarea virusului pe oul embrionat (embrioni de 7-11 zile) constituie gazda pentru myxovirusuri, herpes virusuri.

Inocularea se face intraamniotic, intraalantoidian, pe membrana corio-alantoidiana, intravitelin sau direct in embrion. Se inoculeaza 0,2 ml din produs prelucrat si se incubeaza la 35^o C timp de 2-5 zile. Prezenta virusului se recunoaste prin reducerea miscarilor pana la imobilizarea embrionului, la membre-hemoragii, ingrosarea si opacifierea lor, lichidele embrionare capata activitati proprii virusului(hemaglutinare).

c) izolarea pe animale de laborator

Sunt folositi soareci adulti, soareci nou-nascuti, dihori. Cai de inoculare subcutanata, intracerebrala, intranazala, intraperitoneala. Efectele sunt specifice-incluzii virale, paralizii, inducerea de tumori la animale imunosupresate.

4. Efecte virus specifice pe culturile de celule-exemple

Efecte virus specifice in cultura celulara:

Efect citopatic (ECP) poate fi:

-ECP distructiv-aparitia celulelor rotunjite, globuloase care se desprind de filmul celular si plutesc in mediul de cultivare.

ex: virusurile poliomielitice, virusurile ECHO

-ECP sincitial-determinat de unele mixovirusuri (paragripale,virusul respirator sincitial) apar sincitii celulare multinucleare

-ECP in focar-celulele infectate viral se asaza in grupuri asemanatoare cu un ciorchine de strugure(unele poxvirusuri)

Incluzii virale intracelulare-poxvirusuri

Efectul hemaglutinant:este produs de virusurile gripale, paragripale in prezenta hematiilor de cocos sau om grup "0"

Efectul hemoabsorbant(HAD) consta in atasarea hematiilor de la diverse specii animale la suprafata celulelor virus infectate(virusul rujeolic, paragripal)

Efectul de interferenta-se utilizeaza pe virusuri ce nu determina efect citopatic

Efectul de interferenta-virus citopatogen-ECHO

5. Etapele relatiei virus-celula gazda de tip litic-exemple

Etapele ciclului replicativ viral dureaza intre 6-36 ore:

a)faza de eclipsa-dureaza 10-20 minute imediat dupa infectie

b)faza de crestere lineara care debuteaza initial intracelular

c)faza de platou

Faza de eclipsa cuprinde:

Atasarea virusului de suprafata celulei susceptibile la nivelul unor receptori specifici. Penetrarea reprezinta trecerea virusului din exteriorul celulei in interiorul acesteia. Decapsidarea consta in separarea fizica a acidului viral de invelisurile proteice cu ajutorul enzimelor virus induse si a enzimelor lizozomale celulare.

Cresterea lineara cuprinde:
-sinteza proteinelor timpurii nestructurale si a proteinelor tardive structurale

-faza de platou cuprinde eliberarea virionilor progeni extracelular, reprezinta faza finala

-fenomenul se insoteste de liza celulei gazda

Exemple: bacteriofag-bacterie de tip litic

6. Etapele relatiei virus-celula gazda de tip simbiotic-exemple

Atasarea virusului de suprafata celulei susceptibile la nivelul unor receptori specifici. Penetrarea reprezinta trecerea virusului din exteriorul celulei in interiorul acesteia. Decapsidarea consta in separarea fizica a acidului viral de invelisurile proteice cu ajutorul enzimelor virus induse si a enzimelor lizozomale celulare.

Modalitatea de programare a sintezelor virale este diferita intre virusurile cu genom ADN si ARN:

Virusurile ADN

-ADN-ul viral se integreaza in ADN-ul celular ce va sintetiza un ARN mesager complementar mixt, ce ajunge la ribozomi, dupa citire se vor sintetiza proteine cu secvente de aminoacizi codificati de ADN-ul celular cat si de cel viral

-daca ADN-ul viral nu se integreaza in ADN-ul celular, se produce sinteza de ARN-polimeraza care induce formarea de ARN mesager pe matricea de ADN viral

Virusurile ARN folosesc modelul de replicare denumit revers-transcriptie.

Exemple:bacteriofag-bacterie de tip simbiotic

7. Variatii antigenice virale-importanta medicala

Mutatii virale-greseli in replicarea intracelulara a genomului viral.

Structural:

-mutatii punctiforme-apar prin schimbarea unei baze din codon

-prin deletie-omiterea unui segment din matrita

Mutatiile virale pot fi:

-spontane

-induse

Functional:

-mutante conditionat letal

-mutante atenuate

-mutante rezistente la anumite medicamente antivirale

-mutante legate de citopatogenitate

-mutante legate de citopatogenitate

Recombinarea virala-cuplarea a 2 sau mai multe genomuri virale, avand ca rezultat aparitia unui nou tip de virus numit hibrid viral sau recombinat.

Recombinarile pot fi:

-spontane(naturale)

-dirijate-induse experimental: virusurile gripale pot suferi mutatii virale minore sau majore la nivelul genelor

Reasortarea virala-includerea in aceeasi nucleocapsida a unor segmente de ARN din genomuri virale parentale diferite care infecteaza simultan aceeasi celula, cu conditia respectarii numarului final de segmente inglobate.

Reactivarea incrucisata-infectia mixta a celulei gazda cu virus activ si un virus partial inactivat cu ultraviolete.

Pleitropism si covariatie

Pleitropism-mutantele virale selectate se manifesta fenotipic si prin alte caractere asociate

Covariatia-aspectul practic al fenomenului de pleitropism

Interactiuni genetice intre virusuri-se produc ca urmare a infectiei concomitente a unei celule gazda cu 2 sau mai multe virusuri diferite.

Importanta medicala a fenomenelor genetice virale

a)modificari de patogenitate in lumea virusurilor

b)variatia antigenica si pacatul antigenic originar la virusurile gripale

c)obtinerea de vaccinuri virale atenuate

d)obtinerea de vaccinuri virale recombinate

8. Caile de patrundere ale virusurilor in organism-exemple

-calea tegumentelor si mucoaselor-virusul rabic, virusurile hepatice B,C,D,HIV, virusul herpes simplex

-calea respiratorie-orthomixo si paramixovirusuri, adenovirusuri, picorna si coronavirusuri, virusul gripal.

-calea digestiva-picornavirusurile

9. Stadiile infectiilor virale acute

1. perioada de incubatie-intervalul de timp de la patrundere pana la apritia primelor semne de boala

-incubatie scurta 1-7 zile

-incubatie medie 14 zile

-incubatie lunga 21 zile

2. perioada de invazie-intervalul de timp de la aparitia primelor semne de boala si instalarea tabloului clinic caracteristic bolii:

-perioada preeruptiva

-perioada preicterica

-perioada preparalitica

3.perioada de stare-virusul se multiplica

4. perioada de declin-sfarsitul bolii datorita apararii organismului

5.perioada de convalescenta-vindecarea leziunilor

6.vindecarea-incetarea multiplicarii agentului patogen si a diseminarii lui

10. Vaccinuri virale : clasificare,exemple

Vaccinurile virale pot fi alcatuite din:
corpusculi virali infectati vii atenuati

virusuri salbatice inactivate

A. Vaccinuri virale vii

-vaccinuri virale vii cu virusuri nepatogene:virusul vaccinia pentru vaccinarea antivariolica

-vaccinuri virale vii atenuate:-vaccinul antipolio

-vaccinul antirabic

B. Vaccinuri virale inactivate

-antirabic, antigripal, antipolio, antihepatitic A si B

C. Alte tipuri de vaccinuri virale

-proteine virale recombinate

-peptide sintetice

-construirea de tulpini atenuate

-hibrizi virali

-anticorpi virali

-vaccinurile ADN

11. Tipuri de anticorpi sistemici si locali in viroze-exemple

Anticorpi imunoglobulinici din clasele IgA , IgG , IgM , IgD , IgE

Imunoglobulinele pot fi sistemice (circulante) si locale(IgA secretorii)la nivelul pielii si mucoaselor.

Virusologia speciala

1. Morfologia virusului gripal

Dimensiunea variaza intre 80-120 nm

Forma sferoidala, ovoidala, filamentoasa

Sunt virusuri ARN, cu simetrie helicoidala.

Genomul format din ARN monocatenar situat central, care impreuna cu capsida formeaza nucleocapsida.

Capsida este alcatuita din capsomere dispuse in mod metameric sub forma de elice. Invelisul extern (peplos, anvelopa)-complex glucido-lipido-proteic, alcatuit din elemente "imprumutate" de la celula parazitata de virus, dar si din material codificat de genomul viral.

In invelis sunt ancorate niste proiectii specifice ("spikes") ale unor proteine structurale virus-specifice, cu rol foarte important in variatia antigenica si in stimularea raspunsului imun, denumite hemaglutinina(HA) si neuramidaza(NA) care reprezinta determinanti majori implicati in edificarea raspunsului imun.

2. Aspecte chimice in infectia gripala

Gripa debuteaza cu febra, frisoane, mialgii, cefalee, catar respirator si conjunctival, tuse seaca, astenie si stare generala alterata. La copii poate debuta cu manifestari digestive, varsaturi, diaree. Evolutia dureaza 3-7 zile.

Pot aparea complicatii infectioase, bacteriene, virale, parazitare mai ales la copii si batrani.

Tablou virusologic specific al infectiei cu virusul gripal tip B denumit "Sindromul Reye"

-semne necaracteristice - febra

- tuse

- mialgii

-varsaturi si lipotimie

In perioada de stare - semne de afectare hepatica si a SNC. Paraclinic se constata hipoglicemie, cresterea bilirubinei serice si a transaminazelor.

Mortalitatea e in procent de 90 %.

3. Schema diagnosticului de laborator in gripa

I Recoltare : secretie nazala, exudat faringian, secretie traheala, sange si in caz de deces triturat de

plaman

II Prelucrarea virusului

III Izolarea virusului pe gazde sensibile reprezentate de: - oua embrionate de gaina

- culturi celulare

IV Titrarea virusului gripal izolat prin reactia de hemaglutinare

Se efectueaza dilutii binare din lichidul cu particule virale prezente care se pun in contact cu suspensie de eritrocite de cocos, sau de om grup "0" in concentratie de 0,5 %. Dupa o usoara agitatie si incubare la 4 ^oC , aproximativ 1 ora, se citeste titrul hemaglutinant (1 unitate hemaglutinanta) la dilutia cea mai mare de virus unde s-a produs hemaglutinarea completa.

V Identificarea virusului izolat

a)      orientare dupa efecte: - hemaglutinant si hemadsorbant

b)      serologica: - reactia de inhibare a hemaglutinarii

- reactia de dubla imunodifuzie in gel

c)      imunologica: - HAI

- RFC

Teste de imunitate celulara : - transformare blastica limfocitara

- testul de inhibitie a migrarii macrofagelor

- citometria de flux

4. Epidemiologia si profilaxia gripei.

Sursa de virus este bolnavul, se transmite pe cale respiratorie. Gripa este o afectiune frecventa in sezonul rece. Boala apare in epidemii sau pandemii. Periodicitatea epidemiilor cu virus de tip A este de 2-4 ani, 4-6 ani pentru virusul de tip B. Tulpinile pandemice sunt complet diferite fata de cele anterioare datorita reasortarii genetice. Variabilitatea antigenica inepuizabila a tulpinilor de gripa A este raspandirea lor la numeroase specii de pasari si mamifere.

Exista o profilaxie nespecifica si specifica.

Profilaxia nespecifica - prin aplicarea masurilor de izolare a bolnavilor, limitarea vizitelor la spitale, investigatii serologice pentru testarea anticorpilor serici la populatia umana fata de antigenele gripale standard corespunzatoare subtipurilor circulante.

Profilaxia specifica se bazeaza pe vaccinarea antigripala. Vaccinuri inactivate se prepara prin izolarea recenta a tulpinilor circulante in oul embrionat si apoi se inactiveaza cu formol sau raze UV.

Se administreaza subcutanat, intranazal sau pe cale orala.

Avantajele vaccinurilor inactivate:

-facilitate la administrare

-eliminarea riscului contaminarii cu virusuri hepatice

-reduce infectia cu alte virusuri cu tropism respirator

Vaccinuri vii atenuate - administrate pe cale nazala. Variatia antigenica a tulpinilor de virusuri gripale, instabilitatea genetica ridica probleme in productia de vaccin viu.

Obiectivele programelor de supraveghere si preventie a gripei sunt:

-depistarea precoce a puseelor epidemice

-definirea agentului etiologic implicat

-estimarea impactului gripei asupra populatiei privind morbiditatea si mortalitatea

-definirea grupelor de populatie expusa si cu risc crescut de aparitie a complicatiilor

5. Morfologia virusurilor poliomielitice

Virusurile polio au forma poliedrica si dimensiuni reduse (22-23 nm). Poseda ARN monocatenar simplu, infectios, nesegmentat, inconjurat de o capsida formata din 60 de capsomere in simetrie icosaedrica.

Particula virala este lipsita de invelis, ARN-ul codifica sinteza urmatoarelor proteine:

-proteina VPg - legata de replicarea ARN-ului viral

-polipeptidele majore - VP₁ VP₂,VP₃VP₄

-oligopeptide minore - precursori ai polipeptidelor majore

6. Epidemiologia si profilaxia infectiilor cu virusuri poliomielitice

Poliomielita este o boala ereditara.

Probleme importante:

-infectiile inaparente Þsurse de raspandire a virusului

-prin trecerea interumana din tulpini fara potential neuropatogen sau cu neuropatogenitate slaba

Profilaxia nespecifica consta in aplicarea masurilor de igiena, ameliorarea conditiilor

socio-econimice, ridicarea nivelului de trai .

Profilaxia specifica consta in vaccin

-viu atenuat de tip SABIN polivalent cu administratie orala

-urmarirea excretiei de tulpuni de catre populatia vaccinata

-cresterea titrului de anticorpi specifici sistemici

Avantaje oferite de vaccin :

-usurinta aplicarii

-inducerea rezistentei specifice generale

Dezavantaje :

-in cazul tipului 3 care e mai labil genetic pot aparea mutante neurovirulente prin selectie

-vaccin inactivat

7. Morfologia virusului rujeolos

Aspect de sfera cu diametrul de 100-250 nm.

Virusul e alcatuit din ARN monocatenar, capsida cu capsomerele dispuse dupa simetrie helicoidala si invelis lipoproteic cu 2 tipuri de proiectii:

-hemaglutinina (H)

-factorul de fuziune (F) care sunt glicoproteine

Virusul e alcatuit din 6 proteine structurale. Poseda 3 categorii de antigene:

-hemaglutinant

-hemadsorbant

-fixator de complement

8. Morfologia virusului herpes simplex

Morfologia virala se studiaza prin tehnici de inalta specialitate reprezentata de : difractie cu raze X si microscopie electronica.

Diametrul variaza intre 150-200 nm.

Alcatuire morfologica:

-genom - situat central, format din ADN bicatenar liniar, dar se circularizeaza spontan dupa decapsidare, contine un lant lung "L" si unul scurt "S" unite prin legaturi covalente

-capsida - 162 capsomere dispuse in simetrie icosaedrica, impreuna cu nucleul alcatuieste nucleocapsida

-tegumentul - structura amorfa, proteica, situata intre capsida si anvelopa

-anvelopa - este invelisul exterior, deriva din membrana nucleara a celulei gazda infectata

9. Aspecte clinice in infectia cu virus herpes simplex.

a)Herpesul primar

-leziuni cutanate urmate de prurit si senzatie de arsura sau durere locala persistenta

-leziunile mucoaselor - veziculele se rup la scurt timp de la aparitie datorita umiditatii si sunt inlocuite de mici zone erozive.

b)Herpesul recidivant

-apare la circa 120 zile de la herpesul primar

-infectia evolueaza benign, se vindeca in 10 zile

-localizarile sunt variabile - herpes cutanat(labial,facial), ocular, genital pe gland sau in santul preputial la barbat, la nivelul nevraxului.

c)Herpesul neonatal

-copii nascuti din mame cu herpes genital pot prezenta infectie herpetica

-copii care supravietuiesc au sechele la SNC

d)Relatia herpes genital-cancer

-rolul oncogen a fost dovedit clinic si experimental.

10. Virusul hepatic B - morfologie

VHB e format din 2 tipuri de particule:

-DANE, cu diametrul de 42 nm, reprezinta virionul intact, complet infectios alcatuit din miez central si invelis periferic

-particule neomogene, sferice cu diametrul de 22 nm sau filamentoase lipsite de acid nucleic

Virionul VHB e format din :

Nucleocapsida, cu diametrul de 21-22 nm, formata din genom viral, enzime, capsida.

1) Genom viral - ADN bicatenar, partial monocatenar; in VHB se gaseste extracromozomial dar si integrat in cromozom. ADN are 2 spire L(lunga) si S(scurta). Lantul L are 4 gene care contin informatia genetica pentru sinteza proteinelor virale structurale(AgHBs,AgHBc). Aceste gene se numesc "ferestre de citire informationala" sau ORF.

Gena S -ORF₁ formata din regiuni:-S₁preS₁, preS₁ si preS₂

Gena P-ORF₄

-codifica ADN polimeraza virala capabila sa copieze ARN in ADN si ADN in ARN

Gena C-ORF₂

-codifica proteinele nucleocapsidare("core")

-are 2 codoni start; o regiune pre-core si o regiune core

Gena X-ORF₃

-codifica sinteza proteinelor activatoare a transcrierii genomului viral -HBX

2) Capsida - 180 capsomere asezate in simetrie icosaedrica; contine ADN polimeraza virala care functioneaza ca revers transcriptaza.

-anvelopa - invelis extern al VHB; de natura glicoproteica, alcatuita din dublu strat lipidic si proteine de suprafata.

11. Virusul hepatic C - morfologie

Forma sferica, diametru de 55-65 nm. Alcatuit din nucleocapsida cu diametru de 30-35 nm si invelis extern cu proiectii fine de 6 nm lungime.

Genomul VHC are un lant de ARN monocatenar, poseda o singura gena codanta.

12. Imunomarkeri in infectiile cu virusuri hepatice

1) antigenul de suprafata al VHB(AgHBs)

2) anticorpii fata de AgHBs (anti-HBs)

3) antigenul e al VHB (AgHBe)

4) anticorpii anti AgHBe(anti HBe)

5) anticorpii IgM fata de miezul corpusculului viral(IgM-anti-HBc)

6) anticorpii totali fata de miezul corpusculului viral (antiHBc)

13. HIV - morfologie

Forma sferica cu diametrul de 90-120 nm cu 72 de proiectii exterioare

Componente:

a)Invelisul extern - format din dublu strat lipidic derivat din celula gazda de care sunt atasate glicoproteinele codificate de gena ENV:

- proteina externa

- proteina transmembranara

b)Matricea - tapeteaza virionul si contine:

- proteina MA

- proteina virala PROT

c)Nucleocapsida-cu simetrie icosaedrica

- proteina capsidala (core)-marker al replicarii virale

- proteina nucleocapsidala

- echipamentul enzimatic propriu

- genomul viral format din 2 molecule de ARN monocatenar, la margini regiuni lungi repetitive cu rol de integrare in genomul celulei gazda. Contine gene majore si gene functionale.

Regiuni ce codifica proteine structurale si enzime virale:

- GAG

- POL

- ENV

Regiuni ce codifica proteine reglatoare-functionale:

- TAT,REV,NEF

- VIF

- ART/TRS

Regiuni ce codifica proteine accesorii:

- gena VPR

gena VPX (numai la HIV II)

14. Triada imunologica in infectia cu HIV

1) scaderea raportului CD₄⁺/CD₈⁺ prin diminuarea numarului de CD₄⁺ Th₁

2) hipo sau anergia tuberculinica

3) hipergamaglobulinemia

15. Epidemiologia si profilaxia infectiei cu HIV

Transmiterea se face pe cai multiple:

-pe cale sexuala

-pe cale parenterala (transfuzii cu sange contaminat, seringi)

-verticala (transplacentar in uter, in cursul nasterii prin contactul cu fluidele tractului genital matern)

-prin transplant de organe sau prin sperma

-accidental,profesional

Sursa de infectie este omul cu HIV aparenta sau inaparenta

Grupele de risc sunt:

-homosexualii

-hemofilicii, toxicomanii

-copii nascuti din mame cu SIDA

Profilaxia nespecifica se bazeaza pe educatia sexuala, sterilizarea corecta a instrumentarului chirurgical, perfectionarea mijloacelor de diagnostic de laborator.

Profilaxia specifica activa:

-vaccinuri continand virus intreg : inactivat, viu atenuat

-vaccinuri obtinute prin inginerie genetica (vaccinuri recombinate, peptide sintetice ,vaccinuri recombinate cu vectori vii)