Enzime glicolitice

Enzime glicolitice

Microorganismele produc o varietate de enzime, majoritatea in cantitati mici, care catalizeaza desfasurarea proceselor metabolice. Unele tulpini de microorganisme produc cantitati mari de enzime, pe care le secreta in mediu. In mediile naturale, enzimele extracelulare hidrolizeaza macromoleculele nutritive (proteinele, amidon, pectina, celuloza, lipidele, acizii nucleici), iar monomerii si oligomerii sunt transportati in celula.

Preparatele enzimatice produse de microorganisme prin procese industriale apartin urmatoarelor categorii:

a) enzime hidrolitice: glicozidaze, peptidaze (proteaze), lipaze. Glicozidazele sunt oligozidaze (invertaza) si poliozidaze (amilaze, pectinaze, celulaze);

b) oxidoreductaze (glucozidaza, catalaza);

c) izomeraze (glucoizomeraza).

a-amilaza este cea mai comuna enzima amilolitica^*.

Amidonul este un amestec din doua polizaharide: amiloza, o catena lineara de resturi de glucoza, legate a-1,4; amilopectina, o molecula ramificata formata din lanturi de amiloza, legate prin puncte de ramificare a 1-6. Proportia celor doua tipuri de molecule variaza in functie de sursa, dar amilopectina formeaza circa 70%.

a-amilaza este o endoglicozidaza, ce hidrolizeaza legaturile interne a - l,4 din amiloza, amilopectina si din glicogen. a-amilazele sunt enzime de lichefiere si de zaharificare.

Amilazele de lichefiere hidrolizeaza amiloza, la oligozaharide din 5-6 resturi de glucoza si cantitati mici de maltoza si glucoza. Sunt produse de B. amyloliquefaciens, B. licheniformis, B. stearothermophilus.

Amilazele de zaharificare fac o hidroliza mai eficienta a amilozei, rezultand cantitati mari de glucoza, maltoza, maltotrioza. Ele sunt produse de B. subtilis, iar pentru productia industriala se folosesc fungii A. oryzae, Rhizopus sp.

a-amilazele sunt metalo-enzime cu Ca si necesita cel putin un atom/molecula. Ca²⁺ le confera stabilitate la variatii largi de pH, activitatea optima fiind intre 4,8 si 6,5. Enzimele fungice sunt glicoproteine si activitatea optima este la un pH mai scazut.

Glucoamilaza (amiloglucozidaza) hidrolizeaza legaturile a-1,4 din amilopectina, amiloza si glicogen. (Glicogenul este o forma ramificata de amilopectina). Este o exoenzima ce ataca legaturile de la capatul nereducator al catenei. Enzima hidrolizeaza mai lent si legaturile a-1,6, la punctele de ramificare a amilopectinei. Face o hidroliza aproape totala a amidonului, la glucoza (circa 96%). Enzima este produsa de bacterii, dar pe cale industriala se obtine din culturi de Aspergillus si Rhizopus.

b-amilaza este produsa de bacterii: B. polymyxa, B. cereus, B. megatherium. Este o exoenzima ce ataca legaturile a-1,4 ale amilozei, de la capatul nereducator. Nu hidrolizeaza legaturile a-1,6. Produsul final al hidrolizei este o dextrina.

Amilazele sunt folosite pe scara larga in industria prelucrarii amidonului, unde au inlocuit hidroliza acida clasica.

Procesul de baza incepe cu etapa obtinerii pastei de amidon. Amestecul de amidon-apa, ce contine granule insolubile de amidon se incalzeste la l05-ll0^oC, pentru spargerea granulelor si liberarea amidonului in solutie. Sub actiunea amilazei si glucoamilazei, din amidon (cereale, cartof) se obtine un sirop care contine 40% glucoza, 45% maltoza si restul maltotrioza, utilizat in industria berii, in panificatie, a produselor de cofetarie, a bauturilor dulci.

Prin prelucrarea amidonului se obtin siropuri de fructoza. Fructoza este de doua ori mai dulce decat glucoza si se foloseste ca inlocuitor al sucrozei din alimente si bauturi.

Pentru obtinerea siropului de fructoza, a-amilaza termostabila, adaugata inainte si dupa obtinerea pastei de amidon, scurteaza lantul polizaharidic si reduce vascozitatea polimerului, prin hidroliza partiala la maltodextrine de circa 40 de resturi de glucoza (faza de lichefiere).

In etapa de zaharificare, a-amilazele si glucoamilaza fac o conversie aproape totala a amidonului la glucoza (circa 96%). In etapa izomerizarii, glucozo-izomeraza converteste glucoza la fructoza. Produsul final al actiunii enzimelor este un sirop care contine cantitati egale de glucoza si fructoza, ce se adauga ca indulcitor al bauturilor racoritoare.

Amilazele se utilizeaza in industria alcoolului distilat, pentru zaharificarea pastei de amidon inainte de procesul fermentativ, in panificatie pentru ameliorarea fainii cu activitate a-amilazica slaba (pentru marirea cantitatii de maltoza in timpul pregatirii aluatului), pentru clarificarea sucurilor de fructe si a berii prin hidroliza amidonului, in industria textila pentru indepartarea dextrinei depusa pe firele de bumbac pentru a-i consolida elasticitatea si a le proteja de eroziune in timpul tesutului.

Invertaza (zaharaza, sucraza), produsa in special de levuri, hidrolizeaza zaharoza la un amestec de glucoza si fructoza. Zaharul invertit este mai solubil decat dizaharidul si astfel, concentratia de zahar a unui produs poate fi marita fara sa apara fenomenul de cristalizare.

Enzimele de depolimerizare sunt: izoamilaza (hidrolizeaza legaturile a-l,6 din glicogen); pululanaza- hidrolizeaza legaturile a-l,6 din pululan. (Pululanul este o molecula lineara de unitati de maltotrioza, legate prin punti a-l,6). Aceste enzime sunt produse industrial de K.

pneumoniae si B. pullulyticus.

Proteaze

Proteazele sunt cele mai importante din punct de vedere economic, dintre toate enzimele produse pe cale industriala. Ele reprezinta circa 40% din productia totala de enzime. Proteazele sunt produse de bacterii si fungi, iar in ultimul timp au dobandit importanta practica, proteazele de origine virala. Cele mai multe proteaze comerciale, mai ales neutre si alcaline, sunt produse de g. Bacillus. Proteazele bacteriene neutre sunt active la pH 5-8 si au toleranta termica scazuta.

Se caracterizeaza prin afinitatea lor mare pentru secventele de aminoacizi hidrofobi. Unele proteaze neutre sunt de tipul metaloproteazelor, adica necesita ioni metalici bivalenti pentru activitatea lor si sunt sensibile la prezenta ionilor chelatori, iar altele sunt serin-proteaze si activitatea lor nu este modificata de agentii chelatori.

Proteazele bacteriene alcaline au activitate optima la pH alcalin (l0) si temperatura de 60^o, proprietati care le fac adecvate pentru industria detergentilor.

Proteazele fungice au o diversitate mult mai mare decat cele bacteriene. De exemplu, Aspergillus oryzae secreta proteaze acide, neutre si alcaline. Ele sunt active la pH 4-11, au o specificitate larga de substrat, ca si cele bacteriene, dar rata reactiei si termotoleranta sunt inferioare. Proteazele fungice neutre sunt metaloproteaze, active la pH 7 si sunt inhibate de agentii chelatori.

In mod curent, proteazele se clasifica pe baza a doua criterii:

a) tipul de reactie catalizata;

b) natura chimica a situsului catalitic.

In functie de situsul de actiune, proteazele se subimpart in doua grupe: a) exopeptidaze; b) endopeptidaze.

Exopeptidazele cliveaza legatura peptidica proximala gruparii -NH₂ sau -COOH terminala, iar endopeptidazele cliveaza legaturile peptidice interne ale moleculei proteice din substrat.

Aminopeptidazele actioneaza la nivelul gruparii -NH₂ terminale a catenei polipeptidice si elibereaza un singur aminoacid, un dipeptid sau un tripeptid. Aceste enzime sunt produse de bacterii si fungi si au localizare intracelulara, desi A. oryzae produce o enzima extracelulara.

Carboxipeptidazele actioneaza la nivelul gruparii -COOH terminale a polipeptidului si elibereaza un singur aminoacid sau un dipeptid si se impart in trei grupe majore: serin-, metalo- si cistein-carboxipeptidaze.

Endopeptidazele se caracterizeaza prin actiunea lor preferentiala asupra legaturilor peptidice interne ale catenei polipeptidice. Gruparile -NH₂ sau -COOH au influenta negativa asupra enzimei.

In functie de natura restului de aminoacid la situsul activ al enzimei, endopeptidazele se impart in 4 grupe:

- serin-proteazele au un rest de serina la situsul activ. Au activitate optima la pH 9-11. Sunt produse de B. liqueniformis, B. amyloliquefaciens si de bacili alcalifili;

- metalo-proteazele sunt active la pH neutru si contin un atom de metal, esential pentru activitatea enzimei (de obicei Zn). Sunt sintetizate de B. stearothermophilus;

- cistein-proteazele au un rest de cisteina la situsul activ. Activitatea optima este la pH acid. Sunt produse de cateva tulpini bacteriene, dar pe cale industriala se obtin din plante. Exemplul tipic este papaina;

- aspartic-proteazele sunt proteaze acide, cu activitate optima la pH 3-4. Sunt produse de unele bacterii, dar sunt larg raspandite la mucegaiuri si la levuri. Situsul lor activ are un rest aspartat.

Aplicatii ale proteazelor

Proteazele au o varietate larga de aplicatii, in special in industria detergentilor si cea alimentara, in industria matasii pentru indepartarea gelatinei sau cazeinei folosite ca material protector al fibrelor fata de eroziunea in timpul tesutului, dar si in alte tehnologii.

Ecologizarea unor procese industriale impune aplicarea unor tehnologii, in care, proteazele inlocuiesc unele metode clasice, bazate pe folosirea reactivilor chimici, ca de exemplu, industria pielariei si procesele de bioremediere. Proteazele se folosesc pe scara larga in industria farmaceutica pentru prepararea unguentelor si pentru curatirea ranilor. In scop farmacologic, proteazele se obtin in stare pura, in cantitati mici, iar pentru alte scopuri se produc in cantitati mari si se folosesc ca preparate brute.

Proteazele sunt ingredientele de baza ale detergentilor. In acest scop se foloseste circa 25% din productia de enzime. Proteazele din detergenti trebuie sa aiba specificitate larga de substrat si sa fie active si stabile la pH crescut si temperatura ridicata.

Prelucrarea pieilor parcurge etapele de inmuiere, depilare, samaluire (indepartarea materialului necolagenic - albumina, globuline) si tabacire. Inmuierea, in metoda clasica, s-a facut cu baze, iar acum se folosesc proteazele alcaline. Metoda clasica pentru depilare consta in alcalinizarea si tratamentul cu bioxid de sulf pentru solubilizarea proteinelor radacinii parului.

Acum se folosesc proteaze alcaline cu var si NaCl, ceea ce reduce cantitatea de apa uzata rezultata din procesul industrial. Samaluirea se face cu tripsina pancreatica, cu proteaze din Bacillus, Aspergillus.

In industria alimentara, proteazele se folosesc pentru obtinerea derivatelor din lapte si in panificatie. In industria laptelui, proteazele se folosesc ca agenti de coagulare pentru obtinerea branzeturilor.

In panificatie, proteazele din A. oryzae sunt utilizate pentru proteoliza limitata a glutenului, proteina care determina proprietatile aluatului. Tratamentul enzimatic al aluatului permite obtinerea unei palete largi de produse.

Proteazele alcaline se folosesc pentru prelucrarea fainii de soia, o sursa alimentara bogata in proteine de calitate buna.

Hidrolizatele proteice intra in compozitia produselor dietetice, in dieta copiilor, ca agenti amelioratori ai gustului, dar au inconvenientul major al gustului amar, a carui intensitate este proportionala cu cantitatea de aminoacizi hidrofobi pe care ii contine si in special, de prolina. Peptidazele produse de bacteriile lactice care cliveaza aminoacizii hidrofobi si prolina se folosesc pentru indepartarea gustului amar al hidrolizatelor proteice.

Aspartamul se foloseste ca indulcitor artificial necalorigen si este un dipeptid alcatuit din acid L-aspartic si esterul metilic al L-fenilalaninei. Configuratia L a celor doi aminoacizi ii confera gustul dulce. Pentru sinteza sa este preferata metoda sintezei enzimatice. Desi proteazele sunt enzime hidrolitice, in anumite conditii ele catalizeaza reactia inversa, de formare a legaturii peptidice.

In industria farmaceutica, proteazele din A. oryzae, administrate oral, se folosesc pentru corectarea deficientei unor enzime digestive. Colagenaza de Clostridium sp., in asociatie cu diferite antibiotice, se administreaza pentru tratamentul arsurilor si ranilor. O asparaginaza din E. coli se foloseste pentru eliminarea asparaginei din sange, in variate forme de leucemie

limfocitara.

Celulaze

Hidroliza celulozei cristaline la glucoza este un deziderat de mare perspectiva, dar cu preparatele enzimatice actuale, procedeul nu este economic. Incalzirea globala a climei, datorita emisiei de CO₂, rezultat din arderea industriala a combustibililor fosili, a reinoit interesul pentru utilizarea biomasei in scopul producerii energiei. Trecerea de la combustibilii fosili, la cei derivati din biomasa, ar reduce emisia neta de CO₂ la valori minime.

Celuloza este polizaharidul major sintetizat de plante. Este un polimer linear format din subunitati de glucoza, legate b-1,4. Unitatea repetitiva a celulozei este celobioza (dimer de glucoza). Celuloza este insolubila in apa. Celuloza nativa este formata din microfibrile, care la randul lor contin intre l00 si l4 000 resturi de glucoza. Microfibrilele sunt formate dintr-o alternanta de domenii foarte ordonate, cu structura cristalina si regiuni amorfe. Proportia zonelor cristaline variaza de la 0, in celuloza tratata cu acid si in derivatul solubil carboximetil-celuloza (CMC), pana la l00% pentru celuloza din peretele algei Valonia. De cele mai multe ori, fibrilele de celuloza din peretele celulei vegetale sunt incluse intr-o matrice formata din hemiceluloza si lignina. Hemiceluloza este un complex de polimeri glucidici, in care xilanii si mananii sunt componente principale. Lignina este un polimer rezultat prin condensarea alcoolilor aromatici, rezistent la biodegradare si protejeaza celuloza, de atacul enzimatic al microorgnismelor.

Cea mai mare parte a celulozei se gaseste sub forma lignocelulozei. Procesul degradarii este prea lent pentru a-si gasi aplicabilitate industriala. Diminuarea structurii cristaline (cea mai rezistenta la atacul enzimatic) prin tratamente fizice si chimice si cresterea suprafetei disponibile pentru actiunea enzimelor, sunt caile de optimizare a procesului de degradare a celulozei. Hidroliza hemicelulozei poate fi catalizata de acidul adaugat sau de acidul acetic eliberat din gruparile acetil ale xilanului.

Pe masura ce hidroliza hemicelulozei avanseaza, lignina se separa de microfibrilele de celuloza.

Enzimele celulazice sintetizate de fungi (Trichoderma reesei) sunt amestecuri de exoenzime (celobiohidrolaza), endoenzime si b-glucozidaza. Exoenzima incepe hidroliza fibrilei de celuloza la regiunile amorfe, urmata de hidroliza sinergica sub actiunea endocelulazei, decisiva pentru degradarea polizaharidului. Clostridium thermocellum produce o endoglucanaza sub forma celulosomilor, care hidrolizeaza celuloza nativa, in absenta exoenzimelor. Derivatii solubili ai celulozei (carboxi-metil-celuloza) sunt hidrolizati de diferite endocelulaze produse de bacterii, inactive fata de celuloza nativa.

Celulazele se folosesc pentru degradarea pulpei de fructe, cu scopul cresterii randamentului de extractie a uleiurilor si sucurilor.

Tratarea furajelor de siloz cu enzime celulazice, elibereaza glucidele si grabeste fermentatia lactica, inhiband fermentatia butirica de catre Clostridium si asigura o conservare optima.

Enzimele care degradeaza hemiceluloza, se folosesc pentru inalbirea pastei celulozice din care se fabrica hartia.

Celulazele se utilizeaza ca aditivi ai detergentilor de spalare. Spalarea repetata a textilelor de bumbac, duce la atenuarea culorii, datorita uzurii fibrelor. Actiunea limitata a celulazelor adaugate la detergent, indeparteaza microfibrilele si restabileste culoarea originala a tesaturii.

Lipaze

Substratul lipazelor este molecula de trigliceride cu acizi grasi cu catena lunga. Trigliceridele fiind insolubile in apa, lipazele catalizeaza hidroliza legaturilor ester la interfata dintre faza apoasa si substratul solid.

Lipazele se folosesc ca aditivi in detergentii de spalare si in industria alimentara. Lipazele microbiene se folosesc pentru modificarea grasimilor de origine vegetala.

Sub forma preparatelor polienzimatice (amilaze, proteaze, celulaze, fosfataze), se administreaza la om pentru a compensa insuficienta sucurilor digestive si pentru a combate tulburarile asociate.

Enzimele microbiene se folosesc pentru ameliorarea nutritiei animalelor si a omului. Ele se adauga in hrana animalelor pentru accelerarea digestiei.