Conservarea ex situ a resurselor genetice forestiere de stejar si gorun in Republica Moldova

Conservarea ex situ a resurselor genetice forestiere de stejar si gorun in

Republica Moldova

Conservarea ex-situ a resurselor genetice forestiere

Conservarea ex situ este metoda care necesita miscarea resurselor de germoplasma din habitatul de origine in alte conditii de mediu naturale sau artificiale. (Enescu si Ionita, 2000).

Modalitatile de conservare ex situ sunt, conservarea ex situ dinamica si statica

Conservarea ex situ dinamica presupune conservarea descendentilor unor resurse genetice in conditii de mediu apropiate celor de habitatul de origine. Conservarea este considerata dinamica deoarece presiunile de selectie locala se exercita in permanenta, iar generatiile viitoare sunt modelate de rezultatul unui nou mediu.

Conservarea ex situ statica este caracterizata de posibilitatile de evolutie slabe, astfel ca la maturitate exista aceeasi indivizii multiplicati vegetativ. O modalitate de conservare statica o constituie crioconservarea. (Teissier du Cros E., 2000)

In regimul de conservare ex situ se incadreaza: arboretumurile, gradinile botanice, culturile comparative de proveniente, culturile comparative de descendente materne, culturile comparative de hibrizi, livezile semincere, parcurile de clone si bancile de gene.

Plantatiile de proveniente (teste proveniente) au scopul de a stabili cele mai valoroase resurse geografice de seminte. De asemenea sunt create plantatii ce au rol de conservare a unor proveniente pe cale de disparitie.

Arboretumurile sunt plantatii ce contin un numar mare de unitati sistematice, fiind

reprezentati fiecare prin numar putin de indivizi. Arboretumurile constituie prima etapa de introducere a speciilor exotice.

Bancile de gene include conservarea de polen si seminte dar si de arbori sau populatii care reproduc la scara redusa populatiile panmictice originale.

Prioritate la conservarea resurselor genetice forestiere au speciile de importanta economica si in functie de urgenta conservarii.

Unitati de conservarea ex situ a resurselor genetice forestiere

Conservarea ex situ a stejarului si gorunului include unitati de conservare precum: gradini botanice, arboreturi, plantaje, populatii de ameliorare sub forma de culturi comparative de testare, de proveniente si alte metode astfel in conditii aflate sub control.

Alegerea metodei de conservare ex situ a resurselor genetice de stejar si gorun este dependenta de factori biologici si economici.

Baza semincera din Republica Moldova este constituita din urmatoare unitati de conservare ex situ; plantaje semincere create din clonele arborilor plus; arhive de clone; culturi geografice si ecologice; forestiere si cuprinde urmatoarele componente:

- 12 plantaje semincere cu o suprafata de 57,8 ha;

- culturi geografice de stejar pedunculat pe o suprafata de 17,2 ha;

- culturi ecologice de stejar pedunculat pe o suprafata de 3,5 ha;

- arhive clonale de stejar pufos (1,0 ha) si nuc comun (4,0 ha).

Plantaje semincere (livezi semincere)

In baza semincera a Republicii Moldova sunt incluse 6 unitati de plantajele semincere de stejar (Quercus robur) cu o suprafata totala de 30,1 hectare. Un plantaj este o populatie artificiala realizata in scopul producerii de seminte ameliorate.

Plantajele de seminte sunt plantatii de arbori genetic ameliorati, izolate de polen strain genetic inferior si ingrijite intensiv in scopul producerii frecvente si abundente de seminte usor recoltabile. Plantajele se instaleaza dupa reguli speciale, in conditii stationale favorabile infloririi si fructificarii. Scopul principal al plantajelor este productia de seminte. Procesul de ameliorare si producere a semintelor prin plantaje cuprinde urmatoarele etape:

1. Selectia arborilor plus in interiorul unei rase sau ecotip valoros. Selectia se face pe baza fenotipica. Arborii selectati sunt materialul de baza de la care se porneste ameliorarea.

2. Inmultirea arborilor pe care generativa sau vegetativa.

3. Testarea valorii genetice a arborilor plus. Testarea se face in teste de pepiniera si culture comparative ale descendentilor arborilor plus obtinuti prin polenizare libera sau

controlata, instalate in zonele de cultura pentru care trebuie sa se produca semintele in

plantaje. Analiza tuturor caracterelor si selectia se face la parametri genetici cantitativi.

Cei care dau cei mai valorosi descendenti si au o aptitudine generala si speciala de

combinare a caracterelor interesate pentru selectie se numesc arbori elita

4. Instalarea plantajelor.

Pentru a castiga timp, instalarea plantajelor se face concomitent sau inainte de testarea arborilor plus netestati. Deoarece se presupune in mod justificativ ca insusirile superioare dupa care au fost selectionati sant expresia genotipului. Aceasta premisa a fost dovedita experimental in numeroase culturi comparative cu descendenti ai arborilor plus.

Dupa modalitatea de inmultire a arborilor plus se deosebesc urmatoarele tipuri principale de plantaje: plantaje de clone si plantaje de familii sau descendente.

Plantajele de clone: sunt alcatuite din arbori ce se multiplica pe cale vegetativa.

Plantaje de familii sau descendente: arborii plus se inmultesc din samanta rezultata din polenizare libera sau controlata. Alegerea tipului de plantaj se face in functie de metoda de selectie utilizata. Semintele rezultate in plantajele de familii sunt rezultatul selectiei in generatia arborilor plus si in generatia descendentilor.

Plantajele semincere de descendenta sunt alcatuite din descendente materne ale arborilor plus, folositi in lucrarile de instalare a plantajelor. Aceste culturi indeplinesc un intreit rol de conservare de genotipuri, teste de descendente si plantaje.

Obiectivele selectiei arborilor plus sunt productia de masa lemnoasa, calitatea lemnului si rezistenta la actiunea vatamatoare a unor factori biotici, abiotici si antropogeni.

Totodata unii cercetatori precum Giurgiu V., (1995) si Stanescu V., (1998) sustin necesitatea de reconsiderare a atitudinii fata de plantaje (livezi semincere), precum si fata de modul cum sunt selectati arborii plus, astfel incat pe aceasta cale riscanta sa nu se mai restranga biodiversitatea genetica si ecosistemica a viitoarelor paduri.

Culturi geografice comparative

Sunt instalate dupa reguli speciale avand ca scop separarea componentei genetice de componenta ecologica a fenotipului si stabilirea celor mai valoroase resurse geografice de seminte.

Se pot crea si plantatii care au rol singular de conservare a unor proveniente pe cale de disparitie, care sunt greu accesibile sau de provenienta din alte tari.

In Republica Moldova au fost create doua culturi geografice comparative pentru stejar

pedunculat: la statiunea experimentala Harbovat pentru silvicultura si cea de-a doua a fost creata in cadrul ocolului silvic Briceni (Lipcani).

Un exemplu de cultura geografica comparativa de stejar pedunculat este cea din Statiunea experimentala Harbovat pentru silvicultura, care a fost creata de Efimov I.P in perioada 1968-70.

Obiectivul studiului era cercetarea reactiilor noilor proveniente la noile conditii climaterice si de a studia efectul clinal, variatiile caracterelor morfologice si biologice. Rezultatele finale se vor folosi la efectuarea raionarii semincere si transferului de material reproductiv si delimitarea limitelor de transfer al semintelor.

Cultura geografica comparativa de stejar pedunculat din Statiunea experimentala Harbovat este reprezentata de 50 climatipuri si ecotipuri de stejar pedunculat cu origine din Republica Moldova, Ucraina, Lituania, Belorusia si Rusia.

Primele rezultate ale culturii geografica comparative de stejar pedunculat din Statiunea experimentala Harbovat au indicat o diferentiere a reactiilor primei generatii de stejari provenite din ghinda cu origine geografica diferita. Astfel ca una dintre concluzii a fost importanta originii materialului semincer in crearea culturilor silvice.

Arhivele (colectii) de clone

Arhivele de clone sunt create pentru conservarea arborilor individuali si totodata pentru testarea clonala a valorii lor. Arhivele de clone indeplinesc rolul special de conservare si in acelasi timp material drept genitori pentru hibridari inter- sau intraspecifice ca si la plantaje de clone

Un exemplu de arhiva de clone de stejar pedunculat este cea din statiunea experimentala Harbovat pentru silvicultura care a fost creata de Tisenco V. si Litvinenco D., in perioada 1976 pe o suprafata de 4 ha. Aceasta arhiva de clone este reprezentata de generatia vegetativa a unor arbori plus din Republica Moldova, Ucraina si Rusia.

Gradini botanice

Gradinile botanice contin un numar mare de unitati sistematice, fiecare fiind reprezentata prin putini indivizi. Gradinile botanice constituie o modalitate de conservare a unui numar mare de unitati sistematice.

Gradina Botanica a ASM este detinatorul principal al colectiilor de plante spontane autohtone si alohtone.

Un exemplu de succes de conservare ex situ o constituie expozitia din cadrul Gradinii Botanice (Institut) "Vegetatia Moldovei" creata cu 30 ani in urma pe o suprafata de 14 ha. Colectia cuprinde urmatoarele specii:

- Gorun cu scumpie (Cotinus coggygria) hectare.

- Gorun cu tei (Tilia tomentosa Moench) si frasin (Fraxinus excelsior) -0,7 hectare

- Gorun cu carpen - 0,5 hectares.

- Gorun cu fag - 0,4 hectares.

- Stejar pedunculat - 3,5 ha

- Stejar pufos - 0,5 ha

- Fag - 0,3 ha

Banci de gene

Materialul genetic local a fost supus pentru o lunga perioada de timp factorilor naturali de evolutie, care se reflecta in structura sa ereditara cu gene foarte valoroase, importante pentru adaptabilitate si pentru activitatile de ameliorare.

Bancile de gene sunt create pentru conservarea genofondului valoros al speciilor de plante sau animale in conditii de siguranta.

Bancile de gene include conservarea de polen si seminte dar si de arbori sau populatii care reproduc la scara redusa populatiile panmictice originale.

Obiectivele unei banci de gene sunt: pastrarea colectiei nationale, furnizarea de material biologic cu un inalt nivel de rezistenta la factorii biotici si abiotici pentru programele de ameliorare. Activitatile intreprinse de o banca de gene sunt: colectarea, evaluarea si pastrarea resurselor genetice.

Conservarea resurselor genetice in bancile de gene poate fi efectuata prin crioconservarea genotipurilor valoroase, conservarea la temperaturi de refrigerare 2-5 oC, si la temperatura camerei. Criostocarea genotipurilor cu o valoare de exceptie, in banci de gene poate sa aduca avantaje precum ar fi stocarea pe perioade indelungate de material biologic cu o valoare genetica ridicata. Constituirea de banci criogenice are ca scop atat conservarea biodiversitatii prin prezervarea genotipurilor valoroase cat si a speciilor sau raselor aflate intr-un real pericol de disparitie.

In paralel cu crioconservarea materialului vegetal, se poate perfectiona si tehnici de conservare de durata medie, la temperaturi de refrigerare 2-5 oC, si la temperatura camerei.

Micropropagarea clonala a genotipurilor valoroase de stejar in vederea conservarii exsitu pe termen mediu

Culturile in vitro constituie un material adecvat pentru conservarea ex situ a resurselor genetice, deoarece reprezinta, in cazul alegerii judicioase a explantului initial, genotipuri valoroase (arbori elite, material genetic selectionat in cadrul programelor de ameliorare, ideotipuri valoroase pentru insusiri de adaptabilitate).

Interesul fata de metodele experimentale de embrioidogeneza somatica aplicate la speciile forestiere a crescut in ultimii ani, datorita posibilitatii multiplicarii rapide a materialului genetic in curs de ameliorare.

In prezent exista diverse constrangeri pentru ameliorarea genetica a speciilor de stejari: ghindele sunt recalcitrante la depozitare (2-3 ani), maturitatea stejarului este tarzie (30-50 ani) iar periodicitatea anilor cu fructificatie bogata este foarte mare (5-10 ani).

Unele dintre aceste constrangeri (maturitatea tarzie al arborilor si recalcitranta semintelor la depozitare) pot fi depasite prin folosirea combinata a embrioidogenezei somatice cu crioconservarea.

Embrioidogeneza somatica este un proces nesexual de reproducere, prin care se produc embrioizi bipolari din tesut somatic, fara nici o conexiune vasculara cu tesuturile mama (Haccius, 1978).

Inducerea embrioidogenezei somatice la genul Quercus a fost prima data prezentata de catre

Srivastava si Steinhauer (1982), care au cultivat embrioizi zigotici de Q.lebani.

La stejarul pedunculat (Quercus robur L.) inducerea embrioidogenezei somatice a fost mentionata pentru prima data de Chalupa (1987b, 1990a). Ulterior aceasta metoda a fost perfectionata si la gorun (Quercus petraea (Matt.) Liebl.). Reusita acestei metode se bazeaza pe inductia embrioidogena din explante juvenile (Gingas si Linberger, 1989; Jorgensen, 1988, 1993), iar de curand s-a realizat inductia embrioidogena la stejari si din tesut diferentiat, frunze si lujeri (Cuenca et al., 1999; Hernandez et al., 1999).

Initierea embrioidogenezei somatice dintr-o celula sau grup de celule la plantele lemnoase depinde de natura explantului initial folosit. Cele mai potrivite stadii de dezvoltare din care este prelevat explantul initial sunt: embrionii, ovulele, cotiledoanele, hipocotilele, suspensiile de celule, anterele, polenul, endospermul si primele frunze.

Deosebit de importante pentru realizarea cu succes a embrioidogenezei somatice sunt urmatorii factori: genotipul plantei, sursa de explant, pretratamentele, mediul de crestere, tratamentele secventiale si frecventa subculturilor.

In sectorul biotehnologiilor forestiere, embrioidogeneza somatica este considerata o metoda eficienta pentru manipulare genetica si pentru micropropagarea clonala in vitro in masa a unor genotipuri valoroase. Avantajele acestei metode sunt: rata mare de multiplicare, potentialul de productie in masa (bioreactoare) si posibilitatea dezvoltarii "semintelor artificiale" (Wilhelm E., 2000).

Cu doua decenii in urma "semintele artificiale" erau considerate un mijloc potrivit pentru propagarea in masa a genotipurilor valoroase (Fuji et al., 1987).

Structural, "semintele artificiale" sunt constituite din embrioizi somatici incapsulati intr-un invelis protector care permite nu doar manipularea usoara si conservarea pe termen lung, ci de asemenea ofera embrioizilor elemente nutritive esentiale si regulatori de crestere (Redenbaugh et al., 1987).

In timp s-a constatat ca totusi calitatea embrioizilor somatici este obstacolul principal in eficientizarea utilizarii embrioizilor somatici ca "seminte artificiale" pentru majoritatea speciilor (Merkle, 1995).

La acest moment obstacolul major pentru utilizarea in masa a metodei "semintelor artificiale" la stejar este rata de conversie scazuta si astfel se obtine un numar mic de plante aclimatizate (Wilhelm, 2000).

Tehnica embrioidogenezei somatice poate fi considerata eficienta pentru conservarea genotipurilor valoroase de stejar in conditiile in care exista culturi embrioidogene stabile care produc in mod constant un numar mare de embrioizi somatici prin embrioidogeneza adventiva repetitiva; iar rata de aclimatizare a embrioizilor somatici produsi este suficient de mare.

Crioconservarea ofera avantajul pastrarii pe perioade practic nelimitate a embrioizilor somatici de stejar, pana la evaluarea caracterelor fenotipice valoroase ale arborilor selectionati in conditii stationale.

Conservarea ex situ pe termen mediu a genotipurilor valoroase de stejar. Selectia embrioizilor in vederea conservarii

Culturile embrioidogene de stejar, in regim de multiplicare prin embrioidogeneza adventiva seriala, se prezinta sub forma de mici agregate de embrioizi cotiledonari in diferite stadii de dezvoltare, in care embrioizii sunt mai usor sau mai greu separabili. Formarea noilor embrioizi are loc de regula in zona hipocotila a embrioizilor mai avansati.

Pentru a aplica metoda de conservare prin incapsulare, este necesara includerea embrioizilor separati in capsule de alginat de sodiu (Fig. 41, 42). In aceste conditii, gradul inalt de separabilitate al embrioizilor reprezinta o insusire importanta a culturilor embrioidogene ce trebuie ameliorata in vederea pregatirii materialului pentru conservare.

Pentru experimentele de incapsulare in vederea conservarii pe termen mediu (la temperature pozitive), au fost selectati embrioizi somatici separati.

Viabilitatea embrioizilor somatici incapsulati

Dupa 30 de zile s-a observat o buna supravietuire a embrioizilor somatici, dar diferita in functie de stadiul embrioizilor incapsulati

Astfel embrioizii incapsulati din stadiile superioare au avut o rata de supravietuire de

100%. Embrioizii din stadiile de dezvoltare 4-5 au dimensiuni mai mari (4-10 mm) iar cotiledoanele sunt mari si pace.

Embrioizii incapsulati din stadiile inferioare au avut o rata de supravietuire (85-95%). Dimensiunile acestor embrioizi sunt de (1-4 mm), iar cotiledoanele sunt mici si

foliacee

Embrioizii martori (capsule cultivate pe mediu P24 fara expunere la temperaturi scazute) au avut rata de supravietuire de 96%.

Crioconservarea genotipurilor valoroase de stejar in vederea conservarii ex situ pe

termen nelimitat

In prezent exista diverse constrangeri pentru ameliorarea genetica a speciilor de stejari: ghindele sunt recalcitrante la depozitare (2-3 ani), maturitatea stejarului este tarzie (30-50 ani) iar periodicitatea anilor cu fructificatie bogata este foarte mare (5-10 ani).

Semintele speciilor de stejari face parte din una din cele trei mari grupe de seminte, care sunt clasificate in functie de sensibilitatea lor fata de deshidratare si de particularitatile de pastrare, si anume: seminte normal germinabile, seminte recalcitrante si seminte cu caracter intermediar.

Semintele normal germinabile sunt capabile sa supravietuiasca deshidratari extreme la pastrarea pe perioade lungi si sunt de obicei pastrate in stare uscata. Longevitatea semintelor normal germinabile creste o data cu scaderea continutului apei la cote foarte mici.

Spre deosebire de semintele normal germinabile, semintele recalcitrante trebuiesc mentinute la un nivel critic al umiditatii pentru a mentine viabilitatea lor.

Semintele recalcitrante sunt foarte sensibile la deshidratare si isi pierd foarte repede viabilitatea in cazul pastra la temperatura mediului inconjurator, deoarece au un continut bogat in apa si activitate metabolica activa. De asemenea semintele recalcitrante sunt foarte sensibile la temperaturi scazute (temperaturile de inghet). Astfel o alternativa in pastrarea germoplasmei valoroase poate fi asigurata prin crioconservare (Wendell, 1999).

Unele dintre aceste constrangeri la semintele recalcitrante pot fi depasite prin folosirea combinata a embrioidogenezei somatice cu crioconservarea.

Dezvoltarea tehnicilor de crioconservare reprezinta un progres in biotehnologiile vegetale, deoarece prin intermediul acestei metodologii a devenit posibila conservarea de lunga durata a materialului vegetal cu pastrarea capacitatii regenerative a celulelor criostocate.

Crioconservarea se bazeaza pe oprirea temporara, pe perioada criostocarii, a tuturor activitatilor metabolice de la nivelul celular, consecinta a supunerii acestora la temperaturi foarte scazute. Pentru crioconservare se foloseste azotul lichid, care are o temperatura de -196C sau vaporii de azot lichid, care au o temperatura de -150C.

Principalele aspecte ce se urmaresc prin tehnicile de criostocare si de regenerare sunt: readucerea materialului biologic la functionalitate normala si urmarirea reproducerii indivizilor in descendenta.

Crioconservarea este una dintre metodele cele mai sigure si eficiente pentru conservarea pe termen lung al germoplasmei speciilor cu seminte recalcitrante. Crioconservarea culturilor embrioidogene poate fi de mare folos si de incredere in pastrarea resurselor genetice pe termen lung.

Combinarea embrioidogenezei somatice cu crioconservarea reprezinta un mijloc foarte bun in ameliorarea si selectia genotipurilor valoroase de specii forestiere. Astfel culturile embrioidogene pot fi mentinute prin crioconservare pentru cativa ani, perioada in care genotipurile valoroase sunt selectionate pe baza experimentelor din teren.

Metodele traditionale de crioconservare au urmarit de a conditiona celulele, inainte de imersia in azot lichid, prin racirea controlat treptata cu sau fara tratament cu substante crioprotectoare. Aceste metode necesita sa fie bine optimizate si un echipament de racire foarte scump.

Tehnicile noi de crioconservare se bazeaza pe metoda vitrificarii. Metoda vitrificarii este folosita pentru a simplifica manipularea explantelor si a creste rata regenerarii.

Progresele recente in domeniul embrioidogenezei somatice la stejar a deschis noi

oportunitati pentru propagarea in vitro in masa si pentru manipulari genetice. Culturile

embrioidogene de stejar sunt mentinute prin embrioidogeneza secundara seriala. In ultimul deceniu, crioconservarea embrioizilor somatici a devenit importanta pentru speciile forestiere.

Tehnologia inovativa elaborata la stejar, care combina metodele de incapsulare-deshidratare cu crioconservarea, ofera posibilitatea conservarii embrioizilor somatici in azot lichid cu mijloace simple (fara criostat), asigurand viabilitatea necesara reconstituirii somaclonelor conservate, precum si germinarea embrioizilor conservati (Martinez et all, 2003).

Toate metodele de conservare in vitro a plantelor urmaresc o diminuare sau o stopare temporara sau totala a proceselor vitale. In general sunt acceptate trei modalitati de conservare in vitro cu ajutorul temperaturilor scazute a materialului biologic:

conservarea materialului vegetal pentru o perioada scurta de timp (1-2 luni) prin realizarea de

subculturi repetate,

conservarea materialului vegetal pentru o perioada de timp mediu (de la cateva luni la cca. 3

ani) prin imprimarea la nivelul materialului vegetal a unei cresteri lente,

conservarea materialului vegetal pentru o perioada nelimitata de timp, prin mentinerea culturilor in regim de frig profund (in azot lichid -196C).

Metodele de crioconservare se clasifica in doua grupe si anume:

A. Metode clasice (conventionale):

metoda ultrarapida de congelare;

metoda congelarii lente;

metoda congelarii in picatura;

metoda de congelare uscata;

B. Metode recent dezvoltate (neconventionale):

crioconservarea prin vitrificare;

crioconservarea prin incapsulare (in alginat);

incapsulare-vitrificare

Tehnica de vitrificare este o metoda relativ noua si presupune utilizarea unei solutii de vitrificare, formata dintr-un amestec de mai multi agenti crioprotectori (dimetilsulfoxidul (DMSO), zaharoza, glicerol, sorbitol, manitolul etc.), amestec ce se adauga mediului de cultura.

Din cauza concentratiei ridicate a substantelor crioprotectoare folosite in procesul de pregatire a materialului vegetal pentru vitrificare, in celule are loc transformarea aproape instantanee a continutului celular intr-o masa "vitroasa" (sticloasa) (Towill, 1991; Yamada si colab. 1991).

Vitrificarea, consta in procesul de tranzitie al unei solutii apoase, intr-o masa solida sticloasa, amorfa noncristalina. La temperatura azotului lichid (-196C), solutia crioprotectoare concentrata atinge un anumit grad de vascozitate, astfel incat aceasta se vitrifica fara a se cristaliza.

Pentru vitrificarea materialului vegetal, la contactul cu azotul lichid, acesta trebuie supus unui tratament cu crioprotectori, in concentratii ridicate. Datorita acestui tratament are loc concentrarea solutiilor din interiorul celulei, ca rezultat a patrunderii crioprotectorilor, care va permite la -196C, transformarea intregului continut celular intr-o masa sticloasa. In urma vitrificarii totale a continutului celular, daunele produse de cristalizarea intra- si extracelulara, din timpul congelarii, sunt complet eliminate.

Metoda de crioconservare prezinta urmatoarele avantaje: permite conservarea semintelor recalcitrante; asigura posibilitatea stocarii, intr-un spatiu relativ mic, a unui numar mare de indivizi, fara pericol de contaminare cu agenti patogeni sau de calamitati; pastrarea inoculilor se poate face pe termen nelimitat; inoculii conservati in vitro, deoarece sunt liberi de agenti patogeni, pot fi transportati cu usurinta dintr-o tara in alta, sau dintr-un laborator in altul; permite evitarea pierderiide resurse vegetale valoroase, iar materialul vegetal, criostocat, poate servi oricand ca material

initial de propagare.