SKÚŠKA NEUROVIRULENCIE PERORÁLNEJ OČKOVACEJ LÁTKY PROTI POLIOMYELITÍDE

SKÚŠKA NEUROVIRULENCIE PERORÁLNEJ OČKOVACEJ LÁTKY PROTI POLIOMYELITÍDE

Opice, ktoré sa používajú na skúšku neurovirulencie, musia vyhovovať požiadavkám článku Vaccinum poliomyelitidis perorale (0215) a musia mať najmenšiu hmotnosť 1,5 kg. Patogenita sa skúša na opiciach druhov Macacus alebo Cercopithecus porovnaním s patogenitou referenčného vírusového prípravku na skúšanie neurovirulencie injikovaním do lumbálnej oblasti centrálneho nervového systému po tom, ako sa zvieratám podalo vhodné sedatívum, napr. ketamíniumchlorid. Vzorky sér získané z každého zvieraťa pred injikovaním, riedené v pomere 1:4 nesmú obsahovať neutralizačné protilátky pri skúšaní proti najviac 1 000 CCID₅₀ každého z troch typov poliovírusov.

Počet opíc. Očkovacia látka a vhodný homotypický referenčný vírus sa skúšajú súčasne na tej istej skupine opíc. Táto skupina zvierat sa rozdelí na dve rovnaké podskupiny, z ktorých jednej sa aplikuje referenčný prípravok a druhej skúšaná očkovacia látka. Zvieratá sú náhodne rozdelené do dvoch podskupín a klietok a ich identita je kódovaná. Každé zviera zostáva pozorovateľovi a hodnotiacej osobe v priebehu skúšky neznáme. Počet opíc sa volí tak, aby pri vyhodnocovaní očkovacej látky a referenčného prípravku bolo najmenej 11 pozitívnych opíc pre vírus typu 1 a 2 a najmenej 18 pozitívnych opíc pre vírus typu 3. (Pozitívne opice sú tie,
u ktorých sa prejavia špecifické neurálne poškodenia centrálneho nervového systému vírusom poliomyelitídy). Tým istým homotypickým referenčným prípravkom sa môže skúšať niekoľko šarží očkovacej látky. Ak je to možné, použijú sa opice z tej istej karanténnej skupiny;
v opačnom prípade sa použijú opice pochádzajúce z dvoch skupín, pričom sa aplikuje skúšaná očkovacia látka a referenčný prípravok rovnakému počtu zvierat z každej skupiny. Ak sa skúška vykonáva dva dni, očkuje sa každý deň rovnaký počet opíc z každej skupiny očkovacou látkou a homotypickým referenčným prípravkom.

Obsah vírusu v očkovacích látkach a referenčných prípravkoch. Obsah vírusu v očkovacej látke a v homotypickom referenčnom prípravku sa upraví tak, aby boli čo najbližšie jeden k druhému a má sa pohybovať v rozmedzí 10^5,5 až 10^6,5 CCID₅₀/0,1 ml.

Pozorovanie. Všetky opice sa pozorujú 17 až 22 dní na príznaky poliomyelitídy alebo inej vírusovej infekcie. Opice, ktoré prežijú najmenej 24 h, ale do 11. dňa po injekcii uhynú, sa pitvou vyšetria, či poliomyelitída bola príčinou smrti. Zvieratá, u ktorých nebola príčinou smrti poliomyelitída, sa vylúčia z hodnotenia. Zvieratá ťažko choré alebo s ťažkým ochrnutím sa usmrtia a pitvú. Všetky zvieratá, ktoré prežijú do konca pozorovania, sa pitvú. Skúška je neplatná, ak viac ako 20 % zvierat prejavuje známky pridruženej infekcie v čase pozorovania.

Počet vyšetrovaných tkanivových rezov. Histologické vyšetrenie sa robí prinajmenšom z lumbálnej a cervikálnej miechy, z vyššej a nižšej časti predaženej miechy, stredného mozgu, talamu a z motorických oblastí mozgovej kôry každej opice. Rezy musia mať hrúbku 15 µm a farbia sa galocyanínom. Najmenší počet vyšetrovaných rezov je:

a) 12 rezov reprezentujúcich celkovú lumbálnu intumescenciu,

b) 10 rezov reprezentujúcich celkovú cervikálnu intumescenciu,

c) 2 rezy z predaženej miechy,

d) 1 rez z Varolovho mosta a malého mozgu,

e) 1 rez zo stredného mozgu,

f) 1 rez z ľavej a z pravej časti talamu,

g) 1 rez z ľavej a z pravej motorickej oblasti mozgovej kôry.

Vyhodnotenie vírusovej aktivity. Na vyhodnotenie vírusovej aktivity v rezoch chrbtovej miechy a mozgového kmeňa sa použije stupnica závažnosti poškodení, ktorou sa diferencuje celulárna infiltrácia a poškodenie neurónov

1. sama celulárna infiltrácia (opica sa nepovažuje za pozitívnu),

2. celulárna infiltrácia s minimálnym poškodením neurónov,

3. celulárna infiltrácia s rozsiahlym poškodením neurónov,

4. masívne poškodenie neurónov s celulárnou infiltráciou alebo bez nej.

Získané výsledky sa zaznamenajú na štandardizovanom formulári . Opica, u ktorej sa prejavia poškodenia neurónov na tkanivových rezoch, ale bez stopy po vpichu ihlou, sa hodnotí ako pozitívna. Opica, u ktorej sa neprejavia poškodenia neurónov na tkanivových rezoch, ale sú stopy po vpichu ihlou, sa nehodnotí ako pozitívna. Tkanivový rez, v ktorom sa prejaví poškodenie v dôsledku traumy, ale ktorý neprejavuje nijaké špecifické vírusové poškodenie, sa neberie do hodnotenia.

Vyhodnotenie stupňa poškodenia je založené na hodnotení histologických rezov lumbálnych (L), cervikálnych (C) a mozgových (B). Hodnota poškodenia (HP) pre každú pozitívnu opicu sa vypočíta takto:

Vypočíta sa priemerný počet lézií za každú skupinu pozitívnych opíc.

Vyhodnotenie. Porovnanie aktivity očkovacej látky a referenčného prípravku sa zakladá na vírusovej aktivite v lumbálnej intumescencii miechy a na stupni rozšírenia aktivity z tejto oblasti do cervikálnej intumescencie a mozgu. Rozhodnutie o tom, či sa očkovacia látka prijme alebo nie, závisí od celkových výsledkov získaných zo všetkých skúšaných zvierat. Ak sa u niektorých zvierat prejaví nezvyčajne vysoká aktivita buď v lumbálnej oblasti, alebo rozšírením do iných oblastí, aj tá sa pri konečnom hodnotení berie do úvahy. Monovalentná očkovacia látka v jednej šarži v zásobnej nádobe vyhovuje skúške, ak je požadovaný počet zvierat pozitívny a ak žiadne klinické a histopatologické vyšetrenie nepreukáže signifikantný rozdiel v patogenite očkovacej látky a referenčného prípravku. Kritériá akceptovania očkovacej látky po vyhodnotení neurovirulencie sa uvádzajú ďalej.

Kritériá. S každým referenčným prípravkom (typ 1, 2 a 3) sa urobí vhodný počet kvalifikačných skúšok na neurovirulenciu (napr. 4 skúšky), aby sa získali údaje o aktivite týchto prípravkov, ktoré budú slúžiť ako báza kritérií pre skúšané očkovacie látky. Celkový priemerný počet lézií (M) za vykonanú skúšku s každým referenčným vírusom sa vypočíta súčasne s celkovou odhadovanou hodnotou vnútorného rozptylu (s²) a vnútornou štandardnou odchýlkou (s).

Kritériá platnosti výsledkov skúšky s referenčným prípravkom sa určia na základe kumulatívnych údajov získaných pri kvalifikačných skúškach. Všeobecne platné kritériá nie sú dané. Pre laboratóriá s obmedzenými skúsenosťami s neurovirulenčnou skúškou môže byť užitočná táto empirická metóda na určenie prijateľných limitov priemerných počtov lézií pre referenčný prípravok (X_ref):

Ak je priemerný počet lézií pre skúšanú očkovaciu látku X_test a C₁, C₂ a C₃ sú konštanty, ktoré sa určia podľa nasledujúceho opisu, potom platí:

očkovacia látka sa neakceptuje, ak

X_test – X_ref > C₁,

očkovacia látka sa môže ešte raz vyskúšať, ak

C < X_test – X_ref < C₂.

Ak sa skúška opakuje, priemerné počty lézií sa pre skúšanú očkovaciu látku a referenčnú očkovaciu látku vypočítajú znova. Očkovacia látka sa neakceptuje, ak

Konštanty C₁, C₂ a C₃ sa vypočítajú z týchto vzorcov:

N = počet pozitívnych opíc na skúšanú očkovaciu látku,

N = počet pozitívnych opíc v obidvoch skúškach,

2,3 = normálna odchýlka na úrovni 1 %,

2,6 = normálna odchýlka na úrovni 0,5 %,

1,6 = normálna odchýlka na úrovni 5 %.

Skúška neurovirulencie, pri ktorej priemerný počet lézií pri referenčnom prípravku (X_ref) nie je zhodný s predchádzajúcimi výsledkami, sa nepoužije na vyhodnotenie skúšanej očkovacej látky. Ak je skúška platná, priemerný počet lézií pri skúšanej očkovacej látke (X_test) sa vypočíta a porovná s hodnotou homotypickej referenčnej očkovacej látky.