Determinarea numarului total de germeni prin metoda nefelometrica

Determinarea numarului total de germeni prin metoda nefelometrica

Principiul metodei consta in compararea turbiditatii unei culturi in bulion sau a unei suspensii microbiene, cu turbiditatea unei dilutii standard de germeni sau de pulberi inerte.

In munca de laborator se utilizeaza mai frecvent scarile nefelometrice Mac Farland si Brown, alcatuite pe baza de clorura de bariu. Pentru uniformitatea datelor obtinute mai ales in laboratoarele de producere a vaccinurilor, O.M.S. a stabilit o scara nefelometrica de referinta, cu ajutorul careia se evalueaza opacitatea suspensiilor bacteriene in asa numitele unitati de opacitate (U.O.). Aceasta scara este constituita dintr-o suspensie de particule de sticla Pyrex in apa distilata, tratate prin agitare si spalari consecutive, pana cand particulele de sticla au atins dimensiunea de 1,5 - 3 microni. Concentratia etalon a suspensiei este egala cu 10 U.O., iar eroarea acestei scari nu depaseste 10%, adica o unitate. Dupa aceasta scara etalon s-a trecut la prepararea de subetaloane utilizate in laboratoarele de bacteriologie, cu mentiunea ca numarul de germeni reprezentati de 1 U.O. variaza dupa specia microbiana.

Determinarea numarului de germeni prin metoda culturilor in placi Petri

Prin aceasta metoda se determina numarul de microorganisme aerobe, in majoritate bacterii, fapt ce a determinat ca denumirea metodei sa fie la ora actuala de determinarea numarului total de bacterii aerobe, denumire care se apropie de altfel de cea folosita in literatura americana aerobic plate count (Barzoi si col., 1978). De retinut este faptul ca in majoritatea laboratoarelor exista posibilitati de a se determina numarul de germeni anaerobi, drojdii, mucegaiuri, spori bacterieni.

Tehnica de lucru

Din materialul de examinat se executa dilutii seriate din 10 in 10, procedandu-se astfel: se repartizeaza cu o pipeta gradata sterila cate 4,5 ml din lichidul diluant (mediul de cultura, apa distilata sau ser fiziologic steril) intr-un numar de eprubete. Apoi, cu o alta pipeta se adauga in prima eprubeta 0,5 ml din materialul de examinat, se omogenizeaza bine, obtinandu-se dilutia 1 / 10 (10^-1). Din aceasta eprubeta, cu o alta pipeta gradata se preleva 0,5 ml si se trece in cea de a doua eprubeta, se omogenizeaza rezultand dilutia de 1/100 (10^-2) s.a.m.d. pana la sfarsitul sirului de eprubete. Numarul dilutiilor (eprubetelor) este in functie de bogatia in germeni ce se presupune a o contine materialul de cercetat, in asa fel incat pe placile Petri, coloniile dezvoltate sa poata fi numarate.

Din aceste dilutii se fac insamantari in placi Petri sterile, cate 1 ml pentru fiecare placa Petri, cu mentiunea ca din fiecare dilutie se vor insamanta cel mult doua placi Petri si se noteaza dilutia pe placa Petri. Se toarna in fiecare placa cca. 10 ml mediu solid topit si racit la 45C si se omogenizeaza bine pentru raspandirea uniforma a bacteriilor pe suprafata placii Petri. Placile astfel insamantate se lasa la temperatura camerei pentru solidificarea mediului, dupa care se incubeaza la termostat la 37C, timp de 24 de ore, in functie de specia microbiana.
Aprecierea numarului de germeni se face prin numararea coloniilor care s-au dezvoltat, direct sau cu ajutorul lupei, considerand ca din fiecare germen se dezvolta o colonie.
Pentru numarare se poate folosi fie dispozitivul automat de numarare a coloniilor, fie placile Wolfhugel, Lafar, care au suprafata impartita in sectoare de 1 cm². In acest caz dupa asezarea placii de numarat sub placa Petri se numara coloniile de pe 3 - 5 sectoare de 1 cm², se face media lor si se inmulteste cu suprafata placii Petri.

Numarul de colonii citite pe placa Petri se inmulteste cu titrul dilutiei obtinandu-se numarul de germeni al dilutiei (exemplu: placa insamantata din dilutia 1 / 100000 adica 10^-4 contine 45 de colonii; numarul de germeni se obtine astfel: 45 x 10.000 = 45.000 germeni / ml).

Pentru ca rezultatele sa fie mai precise se va face calculul pentru ce doua placi ale fiecarei dilutii, apoi media pe dilutie, iar ulterior media a cel putin trei dilutii care pastreaza proportia de germeni in functie de gradul de dilutie.