Scrigroup - Documente si articole

Username / Parola inexistente      

Home Documente Upload Resurse Alte limbi doc  

CATEGORII DOCUMENTE





BulgaraCeha slovacaCroataEnglezaEstonaFinlandezaFranceza
GermanaItalianaLetonaLituanianaMaghiaraOlandezaPoloneza
SarbaSlovenaSpaniolaSuedezaTurcaUcraineana

įstatymaiįvairiųApskaitosArchitektūraBiografijaBiologijaBotanikaChemija
EkologijaEkonomikaElektraFinansaiFizinisGeografijaIstorijaKarjeros
KompiuteriaiKultūraLiteratūraMatematikaMedicinaPolitikaPrekybaPsichologija
ReceptusSociologijaTechnikaTeisėTurizmasValdymasšvietimas

Chitozano nanodaleliŲ sintezĖ ir tyrimas - bakalauro studijų baigiamasis darbas

chemija

+ Font mai mare | - Font mai mic







DOCUMENTE SIMILARE

Trimite pe Messenger

VILNIAUS UNIVERSITETAS

CHEMIJOS FAKULTETAS



POLIMERŲ KATEDRA

Lina Pukaitė

Pagrindinių studijų programa Chemija – 4 kursas

Chitozano nanodalelių sintezė ir tyrimas

Bakalauro studijų baigiamasis darbas


SANTRUMPOS

AR – adipo rūgštis

CPAD - (4-cianpentano rūgšties)-4-ditiobenzenkarboksilatas

CR – citrinų rūgštis

DL – deacetilinimo laipsnis

DLS – dinaminė šviesos sklaida

FT-IR – infraraudonoji spektroskopija

GPA – grandinės perdavos agentas

1H-BMR – protonų magnetinis rezonansas

HEMA - 2-hidroksietilmetakrilatas

MSC – molekulinių sietų chromatografija

PL – pakeitimo laipsnis

RAFT - grįžtamoji jungimosi–fragmentacijos grandinės perdavos polimerizacija

Tlyd – junginio lydymosi temperatūra

Tstik – polimero stiklėjimo temperatūra

TTR - 4-Ciano-4[(dodecilsulfaniltiokarbonil)sulfanil]pentano rūgštis

VR – vyno rūgštis


ĮVADAS

Chitozanas – tai linijinis, katijoninis, hidrofilinis aminopolisacharidas, gaunamas iš plačiai gamtoje randamo chitino. Palyginus su chitinu ar celiulioze - chitozanas lengviau chemiškai modifikuojamas, yra tirpus parūgštintuose tirpaluose. Taip pat pasižymi puikiomis biologinėmis savybėmis: yra netoksiškas, biosuyrantis, jam būdingas antibakterinis aktyvumas, biolipnumas. Minėtos chitozano savybės ir palyginus nedideli polimero gavimo kaštai stiprina domėjimąsi juo.

Viena iš chitozano pritaikymo sričių – farmacija, kur polimeras bandomas panaudoti vaistų pernašai. Tai padaryti galima susintetinus chitozano nanodaleles, o biologiškai aktyvias medžiagas ištirpinant, įkapsuliuojant, adsorbuojant, imobilizuojant ar prijungti prie nanodalelės. Priklausomai nuo parinkto metodo bus gaunamos nanodalelės, nanosferos arba nanokapsulės.

Nanodalelės yra pranašesnės už kitas daleles (netgi mikrodales) savo dideliu paviršiaus plotu lyginant su tūriu. Dėl šios priežasties atsiveria įvairi paviršiaus modifikavimo galimybė. Taip pat nanodalelės gali būti funkcionalizuojamos - prie paviršiaus prikabinamos atitinkamos funkcinės grupės (pvz., trumpagrandžiai peptidai), kurios jau gali sąveikauti su biologinėmis sistemomis. Dar vienas svarbus aspektas – jų dydis, siekiantis 200 nm. Tai nanodalelėms leidžia efektyviau judėti bei greičiau pasiekti tikslą. Kita nanodalelių charakteristika - molekulinė masė. Kuo didesnė polimero molekulinė masė – tuo vaistas bus paleistas lėčiau. Nanodalelių stabilizavimas paremtas atostūmio jėgomis tarp krūvį turinčių dalelių arba erdviniais faktoriais.

Dėl pastebėto chitozano nanodalelių suderinamumo su biomolekulėmis ir jų unikalių savybių pagrindinis mūsų darbo tikslas ir buvo susintetinti ir ištirti chitozano nanodaleles.

Uždaviniai:

  1. Susintetinti chitozano nanodaleles, chitozaną modifikuojant di- ir trikarboksirūgštimis karbodiimidiniu metodu;
  2. Chitozano nanodalelių paviršių modifikuojant CPAD bei TTR, susintetinti RAFT makroagentus;
  3. Chitozano nanodaleles “aprengti” polihidroksietil-metakrilato (pHEMA) sluoksniu grįžtamosios jungimosi-fragmentacijos grandinės perdavos (RAFT) polimerizacijos metodu.

1         LITERATŪROS APŽVALGA

1.1      Chitozanas

1.1.1       Chitozano savybės

Chitozanas – tai linijinis, hidrofilinis aminopolisacharidas. Polimeras gaunamas chitino, vieno gausiausiai randamo gamtinio polisacharido, šarminio deacetilinimo metu (1 pav.). Kai yra deacetilinta daugiau kaip 50 % chitino acetatinių grupių, medžiaga vadinama chitozanu. Deacetilinimo laipsnis (DL) komerciniame chitozane svyruoja nuo 60 iki 100 %. Chitino molekulinė masė siekia keletą milijonų, o komerciškai parduodamo chitozano molekulinė masė, priklausomai nuo DL, gali būti nuo keliasdešimt tūkstančių iki kelių milijonų [1-6].

Deacetilinimas2

1 pav. Chitozano gavimo schema [6]

Chitozaną sudaro D-gliukozamino grandys. Polimeras turi vieną pirminę amino ir dvi hidroksigrupes ties trečiuoju ir šeštuoju anglies atomais. Dėl laisvos aminogrupės chitozanas turi teigiamą krūvį ir dėl šios savybės polimeras reaguoja su neigiamą krūvį turinčiais paviršiais ar polimerais. Be to, gali sudaryti chelatus su metalų jonais, ypač kobaltu, bei koordinacinius pereinamųjų metalų kompleksus, kurių stabilumas didėja tokia tvarka: Mn<Fe<C<Ni<Cu<Zn. Tokie kompleksai gali būti naudojami kaip metalų jonų absorbentai, todėl neretai pritaikomi metalams atskirti.Chitozanas taip pat gali formuoti tarpmolekulinius vandenilinius ryšius ir jo tirpalai yra klampūs [1, 2, 7].

Cheminiu požiūriu chitozanas yra silpna bazė, todėl deprotanizavus aminogrupę tampa puikiu nukleofilu (pKa 6,3). Polimeras yra tirpus parūgštintuose praskiestuose vandeniniuose tirpaluose [2] (pH < 6,5), kur gliukozamino grandys virsta į tirpią formą R-NH3+. Šarminiuose ar turinčiuose polianijonų tirpaluose chitozanas iškrenta į nuosėdas ir esant žemesnėms pH vertėms sudaro gelius [1]. Visiškai netirpsta organiniuose tirpikliuose bei vandenyje. Gausus reaktingų grupių skaičius leidžia chitozaną chemiškai modifikuoti bei naudoti susiuvimo reakcijose. Organinėse ir neorganinėse rūgštyse polimeras sudaro druskas.

Chitozanas – tai katijoninis biopolimeras, turintis didelį krūvio tankį (gliukozamino liekanai tenka vienas teigiamas krūvis). Be to, yra geras koaguliantas – sąveikauja su neigiamą krūvį turinčiomis  molekulėmis. Jam būdingas joninis laidumas, adsorbcinės savybės. Chitozanas tinkamas plėvelių formavimui ir biomolekulių izoliavimui, rūgštinėje terpėje pasižymi polielektrolitams būdingomis savybėmis.

Polimerinių medžiagų biologinės savybės ypač svarbios farmacijos srityje. Viena iš chitozano savybių tyrimo priežasčių – bandymas jį panaudoti vaistų pernašai. Taigi, pagrindinės chitozano biologinės savybės yra šios:

·       biologinis suderinamumas – yra netoksiškas, biodegraduojamas/biosuyrantis;

·       biologinis aktyvumas – būdingas antibakterinis ir antigrybinis aktyvumas. Chitozanas stabdo grybų, bakterijų, virusų augimą arba juos visai sunaikina. Jis taip pat pasižymi rūgštingumą mažinančiomis, apsauginėmis savybėmis, o mažos molekulinės masės chitozanas stabdo vėžinių ląstelių augimą. Be to, pastebėtas teigiamas chitozano poveikis mažinant riebalų ir cholesterolio kiekio įsisavinimą į gyvūnų bei žmonių organizmą;

·       bioadhezinės savybės – biologinis sulipimas/biologiniai klijai, t.y., sintetinių ir biologinių makromolekulių sujungimas biologiniais tikslais [1, 2, 5].

1.1.2       Chitozano panaudojimas

Patrauklios chitozano savybės bei palyginus nedideli polimero gavimo kaštai lėmė didelį jo panaudojimo augimą. Chitino produkcija pasaulyje kiekvienais metais siekia 1×1013 kg [4]. Šiuo metu chitozano pritaikymas aprėpia daugybę sričių.

Žemės ūkyje chitozanas naudojamas padidinti derliui, augalų apsaugai bei yra tinkamas dirvožemio apdirbimui. Biomedicinos srityje chitozanas naudojamas medicininių siūlų bei tvarsčių, kontaktinių lęšių gamyboje. Be to, skatina audinių augimą, pasižymi priešvėžinėmis savybėmis. Biotechnologijoje chitozanas puikiai tinka fermentų imobilizavimui, mikrokapsuliavimui, kartu su anijoniniais polimerais formuoja gelius bei kapsules. Taip pat labai svarbus chemijos pramonėje. Metalų chelatų sudarymo savybė pritaikoma vandens gryninimui. Beje, chitozano pritaikymas turi ir ekologinių aspektų, kad ir platus polimero pritaikymas nutekamųjų vandenų valymui ar biosuyrančių plėvelių, naudojamų pakavimui, gamyboje. Kosmetikos srityje chitozanas naudojamas gaminant losjonus, plaukų lakus, rankų ir kūno kremus, šampūnus. Dar viena svarbi sritis – maisto pramonė. Chitozanas dėl savo gebėjimo sudaryti gelį kartais naudojamas tiesiog siekiant pakeisti produkto tekstūrą. Chitozanas neleidžia maistui greitai sugesti, taip pat yra tinkamas dietinio maisto bei skaidulų gamybai, nes suriša cholesterolį, riebiąsias rūgštis, monogliceridus. Polimeras yra puikus emulsiklis bei spalvos stabilizatorius. Vartojamas ir gyvūnų maisto prieduose. Tokioje srityje kaip farmacija puikiai tinka dermatologijos produktams. Dėl polimero netoksiškumo, biosuderinamumo yra tinkamas  ir vaistų išnešiojimui organizme. Be jau paminėtų sričių, dėl antimikrobinių savybių chitozanas pritaikomas tekstilėje, popieriaus pramonėje, nes polimeras stiprus ir drėgnomis sąlygomis; stomatologijoje naudojamas dantų implantų gamyboje; fotografijoje pritaikomas popieriaus gamyboje [2, 5, 8].

1.1.3       Chitozano modifikavimo reakcijos ir darinių klasifikacija

Chitozanas savo chemine struktūra išsiskiria iš kitų polisacharidų. Jis turi tris skirtingas reaktingas grupes (kaip jau minėta anksčiau, pirminę aminogrupę ties antruoju anglies atomu, antrinę hidroksigrupę ties trečiuoju anglies atomu ir pirminę hidroksigrupę ties šeštuoju anglies atomu), o tai leidžia polimerą modifikuoti, ypač lengvai per aminogrupę. Prie chitozano galima prijungti eilę įvairių funkcinių grupių. Dažniausiai pasitaikančios chitozano modifikavimo reakcijos yra karboksimetilinimas, acetilinimas, skiepijimas, o gauti dariniai yra skirstomi į keturias grupes: modifikuotas polimeras, susiūtasis chitozanas, kompozitai chitozano pagrindu ir membranos.

            I.     Modifikuotas polimeras:

o            Karboksimetilchitozanas;

o            Alkilintas chitozanas;

o            Sulfatinio chitozano junginiai;

o            Šakotieji chitozano junginiai, kur atšakas sudaro angliavandeniliai;

o            Skiepytieji chitozano junginiai;

o            Chitozano-ligandų junginiai.

          II.     Susiūtasis chitozanas:

o            Kovalentiškai susiūtos dalelės;

o            Joniškai susiūtos dalelės;

o            Nanodalelės;

o            Fiziniai geliai;

        III.     Kompozitai chitozano pagrindu:

o            Chitozano – dendritų hibridai;

o            Chitozanas, sustiprintas intertinėmis medžiagomis –  silikageliu, stiklo lašeliais, aliuminiu.

        IV.     Membranos.

Viena chitozano darinių atšaka yra susiūtieji chitozano junginiai. Jie gali būti gelių ar dalelių (mikrodalelių, mikrosferų, nanodalelių) pavidalo.

Hidrogeliai gali susiformuoti savaime polimerui kovalentiškai susisiūnant. Susiuvimo agentai turi mažiausiai dvi reaktingas funkcines grupes, kurios leidžia formuoti tiltelius tarp polimero grandžių. Chitozano susiuvimui plačiai naudojami dialdehidai tokie kaip glutaro aldehidas, formaldehidas, taip pat epoksidai, izocianatai ir karboksirūgštys. Susiuvimo tankis labiausiai priklauso nuo agento koncentracijos. Be to, didesnis chitozano deacetilinimo laipsnis yra palankesnis, nes susiuvimo reakcijoms reikia laisvų amino grupių [2].

Susiuvimo reakcijų metu formuojami kovalentiniai ryšiai tarp polimerų grandžių [9]. Kovalentiškai bei erdviškai susiūtos polimerinės medžiagos gali būti gautos paruoštas makromolekules susiuvant mažamolekuliais reagentais arba susidarant tarpmolekuliniams ryšiams tarp polimerinių grandinių. Priklausomai nuo reakcijos sąlygų, galima gauti kompaktines tinklines sistemas su apibrėžta porų struktūra. Pastarosios naudojamos jonų mainams ar kaip stacionari fazė MSC bei panašiose chromatografijose, taip pat kaip substratas peptidų ir oligonukleotidų sintezėje ar fermentams imobilizuoti [10].

Nuo susiuvimo laipsnio labai priklauso medžiagos savybės. Nesusiūti ar nestipriai susiūti polimerai yra minkštesni, lankstesni. Tuo tarpu didelio tinklinimo laipsnio polimerai – trapesni, kietesni. Kai kuriuos polimerus galima susiūti tiesiog naudojant šilumą ir/ar slėgį, kiti susiūnami cheminės reakcijos metu kambario temperatūroje [9].

Be cheminio susiuvimo, gali būti naudojamas ir fizikinis. Jis vyksta formuojant vandenilinius ryšius, pvz., poliamiduose ar poliuretanuose. Fizikinis susiuvimas naudojamas kartu su kovalentiniu arba atskirai. Priešingai cheminiam kovalentiniam susiuvimui, fizikinis susiuvimas yra termiškai grįžtamas [10].

1.2      Nanodalelės

1.2.1       Nanodalelių ypatybės

Nanomokslas, nanotechnologija vis labiau populiarėja, o nanodalelėms skiriama vis daugiau dėmesio. Dedamos didelės pastangos siekiant jas pritaikyti įvairiose srityse: elektronikoje, medicinoje, tekstilėje, maisto pramonėje, žemdirbystėje, kosmetikoje ir kitur [11, 12].

Nanodalelė – tai maža dalelė, kurios bent vienas matmuo yra mažesnis už 200 nm. Išskirtinis nanodalelių privalumas – didelis jų paviršiaus plotas, lyginant su tūriu [11]. Dėl šios savybės jos yra pranašesnės už mikrodaleles [13]. Labai svarbi yra nanodalelių paviršiaus chemija. Pavyzdžiui, silicio nanodalelių vidus užpildytas SiO2, bet cheminė paviršiaus sudėtis bus kitokia – artimesnė formulei Si(O)(2-X). Daugeliu atvejų tiksli paviršiaus sudėtis susijusi su konkrečiu pritaikymu. Paviršius gali būti modifikuojamas metalų jonais, mažomis molekulėmis, paviršinio aktyvumo medžiagomis ar polimerais. Nanodalelės, sąveikaujančios su biologinėmis sistemomis, turi prie paviršiaus prikabintas atitinkamas funkcines grupes (pvz., trumpagrandžius peptidus). [11]. Nanodalelių sistemose biologiškai aktyvios medžiagos (agentai) gali būti ištirpintos, įkapsuliuotos, adsorbuotos, imobilizuotos ar prijungtos prie matricos. Priklausomai nuo parinkto metodo gaunamos nanodalelės, nanosferos arba nanokapsulės (2 pav.).

kap-sfera.bmp

2 pav. Polimerinė nanosfera (a) ir nanokapsulė (b) [12]

Nanokapsulės – tai „pūslelinės“ sistemos, kuriose biologiškai aktyvi medžiaga yra laikoma ertmėje, apsuptoje unikaliu polimeriniu apvalkalu. Tuo tarpu nanosferos yra matricinės sistemos, kuriose medžiaga yra fiziškai tolygiai pasklidusi. Abi sistemos morfologiškai ekvivalenčios mikrosferoms bei mikrokapsulėms. Nanodalelės (3 pav.) naudojamos vakcinoms – injekuotos/įšvirkštos jos gali cirkuliuoti kraujo sistemoje. Naudojamos vėžinių susirgimų gydymui, padidina bioaktyvių baltymų stabilumą bei turi geresnes vaistų atpalaidavimo savybes [13].

0nanodaleles_su_drug.JPG

3 pav. Polimerinė nanodalelė, naudojama vaistų pernašai [14]

Nanodalelės yra mažos, joms būdingas Brauno judėjimas, todėl tokios dalelės turėtų formuoti stabilias dispersijas. Deja, dėl didelės nanodalelių paviršiaus energijos bet koks dviejų dalelių susidūrimas tirpale sukelia aglomeraciją, ir nanodalelės iškrenta į nuosėdas. Dispersiją svarbu stabilizuoti išlaikant atstumą tarp dalelių. Stabilizavimas paremtas atostūmio jėgomis tarp krūvį turinčių dalelių arba erdviniais faktoriais.

Stabilizavimas krūviais galimas tada, kai nanodalelių paviršiuje yra asocijuotų krūvių. Be to, prie dalelės paviršiaus yra tvirtai prisijungusių tirpiklio molekulių, ir tai formuoja vadinamąjį Šterno (Stern) sluoksnį (4 pav.). Šie paviršiuje asocijuoti krūviai sukelia stūmą tarp dalelių, neleisdami nanodalelėms susijungti.

Šterno sluoksnis                                                                           Tirpiklio pašalinimas

a)                             b)   

4 pav. Nanodalelių stabilizavimas: a) krūvių stūma tarp dviejų krūvį turinčių dalelių ir b) erdviškai [11]

Erdviniui stabilizavimuiįtakos gali turėti prie dalelės paviršiaus prisijungusi santykinai ilga tirpikliui gimininga molekulė. Dalelės nusėda tada, kada visas tirpiklis tarp ir aplink grandines pasišalina. Tačiau toks virsmas energetiškai nenaudingas ir nevyksta, todėl ir kuria erdvinį barjerą [11].

1.2.2       Nanodalelių paruošimas

Du pagrindiniai nanodalelių ruošimo metodai yra „top down“ ir „bottom up“. „Top down“ metodu nanodalelės ruošiamos iš medžiagų jas gerokai „apkarpant“, t.y. mažinant kol lieka tik nanodalelė. Dažniausiai tai yra pasiekiama naudojant litografijos technologiją bei ofortą[1]. Komerciniais tikslais labiau naudojamas „bottom up“ metodas. Jis pagrįstas kitokiu principu – čia nanodalelės yra „auginamos“ iš paprastų molekulių, o nanodalelių dydis yra ribojamas įvairiais būdais. Paprasčiausiai nanodalelių dydis valdomas kontroliuojant koncentraciją. Taip pat svarbios kitos priemonės – dalelės paviršiaus funkcionalumas ar augimui naudojamos micelės šablonas.

„Bottom up“ metodu dalelių dydis kontroliuojamas laikantis superprisotinimo principo (5 pav.). Pirmose reakcijos stadijose galutinės  medžiagos koncentracija didėja drastiškai, jokios nuosėdos nesusidaro. Jei reakcija vyksta pakankamai greitai, tuomet prisotinimo riba (grafike žymima brūkšniuota linija) gali būti pasiekta anksčiau nei medžiaga pradės sėsti. Susidariusios pradinės dalelės tampa galinių dalelių „sėklomis“. Esant idealiai sistemai, daugiau jokių naujų produktų neatsiras, o pradinės dalelės augs. Tai yra pagrindinis „bottom up“ metodo veikimo principas [11].

NANO

5 pav. Nanodalelės formavimosi diagrama [11]

1.2.3       Polisacharidinių nanodalelių ruošimo metodai

Nanodalelėms iš polisacharidų gauti naudojami įvairūs metodai: kovalentinis ar joninis tinklinimas, polimer-polimerinis polielektrolitų kompleksavimasis, hidrofobiškai modifikuotų polisacharidų savaiminė agregacija. Gamtinių polisacharidų nanodalelių sintezei plačiausiai naudojamas chitozanas.

Kovalentiškai susiūtos chitozano dalelės gali būti paruošiamos keliais skirtingais metodais: emulsinio susiuvimo, atvirkštinės micelizacijos (reverse micellar), tirpiklio išgarinimo, purškiamojo džiovinimo (spray-drying) arba terminio susiuvimo būdu. Kovalentiniam susiuvimui dažniausiai naudojamas glutaro aldehidas. Deja, ši medžiaga yra toksiška ląstelėms ir tai riboja taikymą vaistų pernašai [15]. Dar naudojami epoksidai, cianatai, karboksirūgštys [16].

Hidrofilinės chitozano nanodalelės gaunamos polisacharido grandinės aminogrupes kovalentiškai susiuvant trumpagrandėmis gamtinėmis dikarboksi- (obuolių (hidroksibutano dirūgštis), gintaro (butano dirūgštis), vyno (2,3-dihidroksibutano rūgštis)) ir trikarboksi- (citrinų (2-hidroksi-1,2,3-propantrikarboksirūgštis)) rūgštimis. Karboksigrupių ir aminogrupių kondensacija vykdoma naudojant vandenyje tirpų agentą – karbodiimidą [15]. Karbodiimidai – tai sintetiniai organiniai junginiai, kurie aktyvuoja karboksigrupę, ir ji panaudojama amidinių ar esterinių ryšių sudarymui. Dažniausiai naudojami – dicikloheksanokarbodiimidas (DCC), N,N‘-diizopropilkarbodiimidas (DIC), 1-etil-3-[3-dimetilaminopropano] karbodiimidas (EDC) [8].

Mažamolekulių di- ir trikarboksirūgščių (maleino, citrinų, vyno) karboksigrupėms, aktyvuotoms karbodiimidais,  sąveikaujant su laisvomis chitozano aminogrupėmis susidaro amidiniai ryšiai ir formuojamos nanodaleles. Šiuo metodu gali būti paruošiamos rūgštiniuose, neutraliuose bei silpnai baziniuose vandeniniuose tirpaluose stabilios polikatijoninės, polianijoninės bei poliamfolitinės nanodalelės (6 pav.). Priklausomai nuo pH vertės, vidutinis dalelių dydis svyruoja 270 – 370 nm intervale [15].

karboksir-kovalentiskai.bmp

6 pav. Kovalentiškai susiūtų chitozano-karboksirūgščių nanodalelių struktūra [16]

Polikatijoninės nanodalelės gaunamos chitozanui sąveikaujant su dikarboksirūgštimis, kai susiuvimo laipsnis mažesnis nei 100 %. Karboksigrupės su chitozano aminogrupėmis sudaro kovalentinius ryšius, o likusios laisvos aminogrupės parūgštintuose tirpaluose protonizuojasi ir gaunamos polikatijoninės nanodalelės. Neutralios nanodalelės gaunamos chitozanui reaguojant su dikarboksirūgštimis, esant stechiometriniam reagentų santykiui.

Nanodalelių sintezei naudojant trikarboksirūgšties, pvz., citrinų, perteklių, kai susiuvimo laipsnis mažiau nei 100 %, formuojasi poliamfolitinės nanodalelės. Tai atsitinka dėl nesuregavusių karboksirūgšties grupių, kurios neutraliuose bei šarminiuose tirpaluose gali būti deprotonizuotos ir taip sukurti neigiamą krūvį, bei dėl likusių laisvų teigiamą krūvį turinčių  chitozano aminogrupių. Esant karboksirūgšties pertekliui, gaunamos polianijoninės nanodalelės, t.y., visos aminogrupės sudaro kovalentinius ryšius, o likusios laisvos karboksigrupės sukuria neigiamą nanodalelių krūvį. Tačiau tokios nanodalelės nėra pakankamai stabilios, todėl iškrenta į nuosėdas [16].

Polikatijoninių (7 pav.) ar polianijoninių polisacharidų joniniam  susiuvimui gali būti naudojami mažamolekuliai  polianijonai ir polikatijonai. Plačiausiai paplitęs polianijonas – tripolifosfatas (TPF), kuris pirmą kartą panaudotas chitozano nanodalelių gamybai 1997 m. Jis yra netoksiškas, pasižymi dideliu anijoninių grupių kiekiu. Atsiradus joninei sąveikai tarp neigiamo TPF bei teigiamą krūvį turinčių  chitozano aminogrupių, formuojamas gelis. TPF-chitozano nanodalelės plačiai pritaikomos vaistų ir makromolekulių pernašoje [15].

joninis_susiuvimas.bmp

7 pav. Joniškai susiūtas chitozanas (- joninis ryšys; + - teigiamą krūvį turintis chitozanas;  - polianijonas) [18]

Šiuo metu nanodalelių ruošimui naudojami ir vandenyje tirpūs chitozano dariniai. Šių junginių privalumas – lengvai ištirpsta neutraliuose vandeniniuose tirpaluose. Taip apsisaugoma nuo žalingo rūgščių poveikio bei yra apsaugomas patalpintų biomolekulių biologinis aktyvumas.

chz-kmc.bmp

8 pav. Chitozano-karboksimetilceliuliozės nanodalelių susidarymo schema [7]

Dėl tarpmolekulinių elektrostatinių sąveikų tarp polielektrolitinio polisacharido ir priešingą krūvį turinčio polimero gali formuotis polielektrolitinis kompleksas (PEK). Teoriškai PEK nanodalelės gali susidaryti iš bet  kokių polielektrolitų, tačiau praktika rodo, kad tinkamiausi vandenyje tirpūs biosuderinami polimerai. Chitozanas – vienintelis polikatijoninis polisacharidas, tenkinantis šias sąlygas. Neigiamą krūvį turinčių polimerų, kurie su chitozanu formuoja nanodaleles, yra labai daug. Jie gali būti suskirstyti į polisacharidus, poliakrilo rūgšties šeimą ir kitus. Vienas tokių – karboksimetilceliuliozė, kuri su chitozanu savaime sudaro stabilias katijonines nanodaleles (8 pav.) [15].

1.3      Grįžtamoji jungimosi–fragmentacijos grandinės perdavos polimerizacija

Grįžtamoji jungimosi–fragmentacijos grandinės perdavos (RAFT) polimerizacija yra viena iš gyvybingosios radikalinės polimerizacijos rūšių. RAFT polimerizacijai būdingos bimolekulinės reakcijos, kur grandinės augimas pagrįstas kooperatine grandinės perdava tarp polimerinių grandinių, o ATRP ir NMP metu vyksta monomolekulinė radikalinė grįžtamoji “sugavimo“ reakcija. Gausus monomerų pasirinkimas bei platus jų funkcionalumas leidžia kurti specifines bei sudėtingas architektūras. RAFT nuo paprastos radikalinės polimerizacijos skiriasi tuo, kad šiuo atveju naudojamas grandinės perdavos agentas (GPA). GPA dažniausiai turi tiokarboniltiogrupę ir reakcijos pabaigoje sudaro RAFT makroagentus. Sintetinamų polimerų vidutinės molekulinės masės apskaičiuojamos pagal formulę (1), todėl parinkus tinkamas reagentų (GPA, monomero, iniciatoriaus) koncentracijas, reakcijos sąlygas, galima gauti norimos molekulinės masės polimerą.

(1)

Sintetinamos vandenyje tirpios arba amfifilinės polimerinės struktūros, prie kurių gali būti jungiami įvairūs agentai. Gali būti sintetinami statistikiniai, gradientiniai, blokiniai, šepečio struktūros, žvaigždiniai, superšakotieji ir tinkliniai kopolimerai (9 pav.) [19-21].

raft_samplies.bmp

9 pav. RAFT polimerizacijos produktų pavyzdžiai: a) gradientiniai kopolimerai, b) statistikiniai kopolimerai, c) žvaigždiniai polimerai [19]

RAFT polimerizacija plačiai taikoma vaistų nešikliams kurti. RAFT polimerizacijos pagalba galima gauti branduolio/apvalkalo formos nano- ir mikrodaleles bei kapsules. Redukavus tiokarboniltiogrupę, gaunama laisva tiolio grupė, kuri gali būti apsaugoma Ellmano reagentu ir toliau dalyvauti reakcijose su fluorescuojančiais peptidais ar DNR. RAFT polimerizacija  gali būti vykdoma dispersinėse terpėse. Šiuo metodu sintetinami ir termogrįžtamieji hidrogeliai. Vienas iš tokių pavyzdžių – poli(NIPAAm[2])-blok-poli(N,N-dimetilakrilamido)-blok-poli(NIPAAm) triblokkopolimeras, kuris pasiekus poli(NIPAAm) virsmo temperatūrą, tampa grįžtamuoju fizikiniu geliu. Gelio mechaninės savybės panašios į kolageną – biopolimerą, plačiai taikomą audinių inžinerijoje [19].

2        METODINĖ DALIS

2.1      Naudotos medžiagos ir tirpalai

2.1.1       Reagentai

Chitozanas, Sigma-Aldrich

Vidutinės molekulinės masės(400 000), DL 72 %

Heksano dirūgštis, (1,4-butandikarboksirūgštis, adipo rūgštis), Sigma-Aldrich

C6H10O4, Mr 146,15, ρ 1,36 g/cm3, Tlyd 149-150 °C, Tvir. 337 °C, pKa1 4,43, pKa2 5,41

3-Karboksi-3-hidroksipentano dirūgštis, (2-hidroksi-1,2,3-propantrikarboksirūgštis, citrinų rūgštis)

C6H8O7, Mr 210,14, ρ 1,665 g/cm3, Tlyd 153 °C, Tvir. 175 °C, pKa1 3,15, pKa2 4,77, pKa3 6,40

2,3-Dihidroksibutano dirūgštis (vyno rūgštis)

C4H6O6, Mr 150,09, ρ 1,79 g/cm3, Tlyd 171–174 °C (L-vyno), Tlyd 206 °C (DL, racematas), Tlyd 146–148 °C (mezo)

(4-Cianpentano rūgšties)-4-ditiobenzenkarboksilatas (CPAD)

C13H13 N O22S2, Mr 256

4-Ciano-4[(dodecilsulfaniltiokarbonil)sulfanil]pentano rūgštis (TTR)

C19H33N2O2S3, Mr 403,67, Tlyd 64-68 °C

1-Etil-3-[3-dimetilaminopropano]karbodiimido hidrochloridas (EDC), Merck

C8H18N3Cl, Mr 191,70, ρ 0,88 g/cm3, Tvir. 47–48 °C

4,4-Azodiizo(4-cianpentankarboksirūgštis) (ACPR)

C12H16N4O4, Mr 280,30, Tlyd 118-125 °C

2-Hidroksietilmetakrilatas (HEMA)

C6H10O3, Mr 130,14, ρ 1,073 g/cm3

Natrio chloridas

NaCl, Mr 58,44, ρ 2,17 g/cm3, Tlyd 801 °C, Tvir. 1413 °C, nD 1,54



Natrio hidroksidas (natrio šarmas)

NaOH, Mr 40, ρ 2,13 g/cm3, Tlyd 318 °C, nD 1,412

Kalio hidroksidas (kalio šarmas)

KOH, Mr 56,11, ρ 2,04 g/cm3, Tlyd 420 °C, Tvir. 1327 °C, nD 1,41

Acto rūgštis

C2H3O2H, Mr 60,05, ρs 1,049 g/cm3, Tlyd 16,5 °C, Tvir. 118,1 °C, pKa 4,76

1,4-Dioksanas

C4H8O2, Mr 88,11, ρ 1,03 g/cm3, Tlyd 11,8 °C, Tvir. 101,1 °C

Druskos rūgštis (vandenilio chloridas)

HCl, Mr 36,46, ρ 1,18 g/cm3, nD 1,342, Tvir. 110 °C (20,2 % tirpalas), Tvir. 48 °C (38 % tirpalas), Tlyd -26 °C (38 % tirpalas)

Metanolis

CH4O, Mr 32,04, ρ 0,79 g/cm3, Tlyd −97 °C, Tvir. 64,7 °C,

2.1.2       Buferiai

0,5 M CH3COOH/ 0,5 M CH3COONa

0,2 M CH3COOH/ 0,15 M CH3COONH4

2.2      Sintezės metodikos

2.2.1       Chitozano N-modifikavimas adipo rūgštimi

0,0127 g (0,0867 mmol) adipo rūgšties ištirpinama 10 ml vandens ir 0,1 M NaOH tirpalu pašarminama iki pH 6,5. Atšaldžius ledo vonioje, įdedama 0,0499 g (0,26 mmol) EDC ir 30 min. stipriai maišoma magnetine maišykle (850 aps/min). Į gautą mišinį sulašinamas 0,15 % chitozano tirpalas, gautas 0,1508 g (0,867 mmol) liofilizuoto chitozano (DL = 72%) ištirpinus 100 ml 2 % acto rūgšties ir 0,1 M NaOH tirpalu pašarminus iki pH 6,5. Reakcija vykdoma 24 val. kambario temperatūroje maišant magnetine maišykle. Reakcijai pasibaigus, reakcijos mišinys 72 val. dializuojamas vandenyje naudojant Visking (SERVA, MWCO 12 000-14 000) dializės žarną ir liofilizuojamas. Išeiga 0,1102 g (71,35 %, kai PL 13 %).

Chitozano modifikavimas vyno ar citrinų rūgštimis vykdomas pagal tą pačią metodiką.

2.2.2       Adipo rūgštimi modifikuoto chitozano N-modifikavimas TTR

0,04 g (0,1 mmol) 4-cian-4[(dodecilsulfaniltiokarbonil)sulfanil]pentano rūgšties (TTR) ištirpinama 10 ml 1,4-dioksano ir 0,1 M NaOH tirpalu pašarminama iki pH 6,5. Tirpalą atšaldžius ledo vonioje, į jį įdedama 0,1 g (0,5 mmol) EDC. Į gautą mišinį lėtai sulašinama 0,1 g (0,5 mmol) adipo rūgštimi modifikuoto chitozano (PL 13 %), ištirpinto 10 ml 2,0 % acto rūgšties, prieš tai 0,1 M NaOH tirpalu padidinus jo pH iki 6,5. Reakcija vykdoma 24 val. kambario temperatūroje maišant magnetine maišykle. Po to tirpalas 72 val. dializuojamas vandenyje naudojant Visking (SERVA, MWCO 3500) dializės žarną. Produktas liofilizuojamas 40 sC temperatūroje. Išeiga 0,0698 g (kai PL 13 %).

N-modifikavimas kitu RAFT perdavos agentu – CPAD – vykdomas pagal tą pačią metodiką.

2.2.3       HEMA polimerizacija RAFT būdu

0,05 g (0,231 mmol) adipo rūgštimi ir TTR modifikuoto chitozano ištirpinama 2 ml 2 % acto rūgšties. Įdedama 0,8678 mg (0,0031 mmol) iniciatoriaus (ACPR) bei 0,04 ml (0,3096 mmol) 2-hidroksietilmetakrilato (HEMA). Polimerizacijos mišinys prapučiamas 40 min. N2 dujomis. Polimerizacijos reakcija vykdoma 6-8 val. 60 sC temperatūroje, maišant magnetine maišykle. Pasibaigus reakcijai, mišinys 72 val. dializuojamas vandenyje naudojant Visking (SERVA, MWCO 3500) dializės žarną. Produktas liofilizuojamas 40 sC temperatūroje. Išeiga 0,0410 g .

Polimerizacijos reakcija naudojant kitą RAFT makroagentą – adipo rūgštimi ir CPAD modifikuotą chitozaną – vykdoma pagal tą pačią metodiką.

2.3      Analizės metodikos

2.3.1       Karboksigrupių kiekio nustatymas

Analizinėmis svarstyklėmis pasveriama 0,05 g tiriamo polimero ir ištirpinama 20 ml metanolio. Kadangi medžiaga blogai tirpsta, kolba sujungiama su grįžtamuoju aušintuvu ir 1 val. kaitinama. Po to, tirpalas atvėsinamas ir titruojamas 0,1 M metanoliniu KOH tirpalu, indikatoriumi naudojant alkoholinį fenolftaleino tirpalą. Tirpiklio neutralumui patikslinti daromas kontrolinis bandymas. Karboksigrupių kiekis apskaičiuojamas iš ne mažiau kaip dviejų lygiagrečiai darytų analizių.

Karboksigrupių kiekis XCOOH (%) tiriamojoje medžiagoje apskaičiuojamas pagal formulę:

(2)

čia:      V1 ir V2 – KOH tirpalo, sunaudoto tiriamajai medžiagai ir kontroliniam bandiniui titruoti, tūris, ml;

C       – KOH tirpalo koncentracija, mol/g;

45      – COOH grupės santykinė molekulinė masė;

            g        – bandinio masė, g.

2.3.2       Aminogrupių kiekio nustatymas

0,1 g tiriamos medžiagos ištirpinama 20 ml 0,1 M HCl ir titruojama 0,1 M NaOH. Indikatoriumi naudojamas metileno mėlynojo ir metileno raudonojo mišinys. Daromi du kontroliniai bandiniai.

Pirminių aminogrupių kiekis XNH2 (%) apskaičiuojamas pagal formulę:

(3)

čia:                V1 ir V2 – NaOH tirpalo, sunaudoto tiriamajam ir kontroliniam tirpalui titruoti, tūris, ml;

                      c                    – KOH tirpalo koncentracija, mol/g;

                      16                  – NH2 grupės santykinė molekulinė masė;

          g                    – bandinio masė, g.

2.3.3       Chitozano pakeitimo laipsnio jo kopolimeruose skaičiavimas

Pakeitimo laipsnis (PL, %) parodo, kiek vidutiniškai grandinių yra prijungta prie 100 chitozano grandžių.

Chitozano N-darinių pakeitimo laipsnis (PL) apskaičiuojamas iš 1H-BMR spektrų, lyginant priskiepytai grandinei būdingų protonų ir chitozano acetilgrupės ties 1,8-1,9 ppm arba H-2 protono ties 2,97 ppm signalų intensyvumus pagal formules:

,          (4)

,                  (5)

čia:     H     – analitinio protonų signalo priskiepytoje grandinėje smailės plotas;

          n      – analitinio signalo protonų, esančių priskiepytoje grandinėje, skaičius;

A       – acetatinės grupės signalo plotas;

B        – H-2 protono signalo plotas.

2.3.4       Spektroskopinis chitozano darinių tyrimas

Tiriamos medžiagos FT-IR spektrai užrašyti iš KBr tablečių PERKIN ELMER 1000 Spectrum BX spektrometru sausame ore 20 sC temperatūroje. Skenavimo parametrai: ribos 520–3600 cm-1, 16 skanų, skiriamoji geba 2 cm-1. 1H-BMR spektrai užrašyti UNITY INOVA Varian 300 MHz spektrometru 5 mm BMR ampulėse 29 °C temperatūroje. Tirpalai buvo ruošiami D2O arba D2O, turinčiame 1 lašą DCl arba acto rūgšties-d4.

2.4      Chitozano darinių savybių tyrimas

2.4.1       Ribinio klampos skaičiaus nustatymas

Paruošiami 0,15 g/dl koncentracijos polimerų tirpalai acetatiniame buferyje (0,5 M CH3COOH/ 0,5 M CH3COONa). Tirpalų klampa buvo matuojama Ubelodės viskozimetru 25 sC temperatūroje. Praskiedimams naudojama tiek acetatinio buferio, kad susidarančiame tirpale pradinio polimero tirpalo būtų 2/3, 1/2, 1/3 ir 1/4. Ribinis klampos skaičius ([η]) nustatomas klampos skaičių (ηred) ir logaritminį klampos skaičių (ηln s) ekstrapoliuojant į nulinę koncentraciją.

2.4.2       Potenciometrinis titravimas

0,025 g medžiagos ištirpinama 5 ml 0,01 M HCl/0,1 M NaCl ir potenciometriškai titruojama 0,05 M NaOH/0,1 M NaCl tirpalu, kiekvieną kartą sulašinant po 0,05 ml 0,05 M NaOH/0,1 M NaCl. Įpylus šarmo, tirpalas apie 1 min. maišomas ir tik tuomet užrašomi pH-metro CyberScan pH6000 rodmenys. Titruojama tol, kol pH vertė pasiekia 11-12. Nubrėžus potenciometrinio titravimo kreivę, grafiniu būdu nustatomas visiško neutralizavimo (ekvivalentinis) taškas. Nustačius ekvivalentinį tašką, apskaičiuojamas polielektrolito jonizacijos laipsnis α kiekvienam potenciometrinės kreivės taškui. Susitarta, kad visiško neutralizavimo taške jonizacijos laipsnis α=1, o pradiniame tirpale (prieš neutralizaciją) – α=0. Pasinaudojant polielektrolito titravimo kreive, surandamos pH vertės, atitinkančios jonizacijos laipsnį 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8 ir 0,9. Iš gautų duomenų brėžiama priklausomybė Henderson‘o ir Hazelbalch‘o lygties koordinatėse, t.y. tirpalo pH priklausomybė nuo lg[α/(1-α)].

2.4.3       Poliamfolito izoelektrinio taško nustatymas

Atliekant tiriamų junginių 0,03 M HCl ar 0,03M HCl/0,1 M NaCl tirpaluose potenciometrinį titravimą 0,03 M NaOH ar 0,03 M NaOH/0,1 N NaCl, pasiekus pH vertes 4, 4,25, 4,5, 4,75, 5, 6, 7, 8, 9, supaprastintos konstrukcijos 0,54 mm diametro kapiliaro viskozimetru matuojama tirpalo santykinė klampa. Kiekviename taške tirpalo ištekėjimo laikas matuojamas ne mažiau kaip 3 kartus ir apskaičiuojama vidutinė τ vertė. Prieš kiekvieną naują matavimą viskozimetras praplaunamas matuojamu skysčiu – į talpyklą kelis kartus įsiurbiamas tirpalas leidžiant jam ištekėti.

Nubrėžus tirpalo savitosios klampos priklausomybę nuo pH, nustatomas medžiagos izoelektrinis taškas – pH vertė, kuriai esant tirpalo savitoji klampa yra mažiausia.

2.4.4       Molekulinių sietų chromatografija

Molekulinių sietų chromatografija yra santykinis polimerų molekulinės masės nustatymo metodas. Šio proceso metu makromolekulės yra frakcionuojamos pagal jų hidrodinaminį tūrį. Ištirpusio polimero tirpalas, turintis platų molekulinių masių pasiskirstymą, yra paleidžiamas pro chromotografines kolonėles.

Polimerų molekulinė masė nustatoma naudojant molekulinių sietų chromatografijosįrangą, kurią sudarė trys detektoriai –  šviesos sklaidos detektorius PL-ELS-1000, UV detektorius UVD-250 ir lūžio rodiklio (IR) detektorius Viskotek TDA Model 301, automatinio bandinių paėmimo įrenginys Midas (Spark Instruments, The Netherlands), siurblys (Watrex Comp.) ir dvi kolonėlės PL Aquagel-OH MIXED (8 μm), tinkančios tirti  medžiagas, kurių molekulinė masė 100 – 1 106 g/mol, vandeniniuose tirpaluose.

Paruošiami 1 % polimerų tirpalai acetatiniame buferyje (0,15 M CH3COONH4/ 0,2 M CH3COOH; pH = 4,2). Bandiniai filtruojami pro 0,45 μm filtrą, supilami į indelius ir talpinami į Midą. Duomenys kaupiami ir apdorojami naudojant Astra ir tri-SEC programines įrangas.

2.4.5       Dinaminė šviesos sklaida

Šviesos sklaidos metodas paremtas mažų dalelių, esančių tirpaluose, Brauno judėjimo tyrimu. Šiuo metodu matuojamas atsispindėjusios nuo polimero tirpale esančių makromolekulių šviesos srauto intensyvumas.

Dalelių hidrodinaminis spindulys nustatomas dinaminės šviesos sklaidos pagalba. Paruošiami 1 % bandiniai acetatiniame buferyje, filtruojami pro 0,45 μm porų dydžio filtrus. Kalibravimui naudojamas toluenas, kuris pasižymi didele  šviesos  sklaida. Tyrimas atliekamas 25 °C temperatūroje. Pirmiausiai matuojama tirpiklio, o tik paskui tiriamo tirpalo šviesos  sklaida. Kiuvetė su tiriamu mėginiu įstatoma į specialią celę taip, kad lazerio šviesa gerai praeitų. Eksperimento metu naudojamo 30 mW He-Ne lazerio bangos ilgis – 632 nm, o lazerio šviesos sklidimo kampas – 90°. Matuojamos intensyvumų fliuktuacijos/svyravimai, kurie perskaičiuojami į intensyvumų koreliacijų funkcijas –išsklaidytos šviesos intensyvumo priklausomybes nuo laiko. Duomenys kaupiami ir apdorojami naudojant ALV programinę įrangą. Gaunama koreliacijos funkcija, reikalinga difuzijos koeficientui surasti (D). Tiriamų dalelių hidrodinaminis spindulys (Rh) apskaičiuojamas pagal lygtį:

(6)

čia:      k        – Bolcmano konstanta,  erg/K;

T       – absoliučioji temperatūra, K;

η        – tirpiklio klampa.


3        REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

Šio darbo metu buvo susintetintos ir ištirtos chitozano nanodalelės bei jų dariniai. Nanodalelės gautos vidutinės molekulinės masės chitozaną (DL=72 %) per aminogrupę veikiant mažamolekulėmis di- ir trikarboksirūgštimis. Prie chitozano nanodalelių prijungiant RAFT grandinės perdavos agentus CPAD bei TTR, buvo bandoma susintetinti polisacharidinį RAFT makroiniciatorių, nuo kurio paviršiaus vykdant hidroksietilmetakrilato (HEMA) RAFT polimerizaciją, būtų galima gauti nanodaleles biotechnologijos ar biomedicinos reikmėms.

Gautieji chitozano dariniai buvo identifikuoti iš jų FT-IR, 1H-BMR spektrų, išmatuota jų tirpalų klampa, molekulinių sietų chromatografijos (MSC) metodu nustatyta molekulinė masė, dinaminės šviesos sklaidos metodu (DLS) nustatyti dalelių dydžiai, potenciometriškai nustatytos susintetintų nanodalelių pKa vertės bei aminogrupių kiekis. Chitozano pakeitimo laipsnis (PL, %) buvo apskaičiuojamas iš 1H-BMR spektrų.

3.1      Chitozano nanodalelių sintezės rezultatai

Chitozano dalelės pasižymi bioadhezinėmis savybėmis. Be to, jos naudojamos vaistų nešikliams kurti. Teigiamai įkrautas chitozanas gali sąveikauti su neigiamai įkrautomis molekulėmis (DNR, RNR) jas stabilizuodamas ar apsaugodamas nuo skilimo.

Chitozano nanodalelės buvo susintetintos karbodiimidiniu metodu, kovalentiškai susiūnant chitozaną mažamolekulėmis di- ir trikarboksirūgštimis. Chitozanas yra gamtinis polimeras, o iš jo padarytos nanodalelės gali būti taikomos medicinoje. Sintezei vykdyti pasirinktos natūralios karboksirūgštys: adipo (AR), vyno (VR) ir citrinų (CR) (10 pav.).

800px-Adipic_acid_svg                 625px-Tartaric_acid_svg                      256PX-~1

a)                                                      b)                                                   c)

10 pav. Chitozano modifikavimui naudotos karboksirūgštys: a) adipo, b) vyno, c) citrinų

Karboksirūgštys prie chitozano aminogrupių buvo jungiamos karbodiimidiniu metodu, naudojant vandenyje tirpų karbodiimidą N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilkarbodiimido hidrochloridą (EDC) (11 pav.).

untitled.PNG

11 pav. Chitozano modifikavimas dikarboksirūgštimis

EDC arba EDAC – tai 1-etil-3-[3-dimetilaminopropano]karbodiimido hidrochloridas. Jis tirpus ne tik vandenyje, bet ir metileno chloride, N,N-dimetilformamide (DMF), tetrahidrofurane (THF). EDC komerciškai dažniausiai parduodamas HCl ar jodmetano druskų pavidalu. Agentas naudojamas amidų, esterių ar tioesterių ryšių sudarymui, formuojant heterociklinius žiedus. Be to, gali būti naudojamas skersiniams ryšiams baltymuose, nukleorūgštyse sudaryti, vandeniniuose ar organiniuose tirpaluose įvairioms molekulėms prie paviršiaus prijungti. Jis neatsparus stiprių oksidatorių ar stiprių rūgščių poveikiui. EDC aktyvus 4,0 - 6,0 pH intervale [17, 22-23].

Vandenyje tirpi karbodiimido HCl druska pasižymi ilgalaikiu stabilumu. Ji nehidroskopiška, nors šiek tiek jautri hidrolizei. Būdinga žiedinė tautomerija (12 pav.). Karbodiimido tirpalo chloroforme IR sugerties spektre matyti sugertiems juosta ties 2130 cm-1, kuri būdinga atviroje grandinės formoje esančiai –N=C=N- grupei. Tuo tarpu kietos druskos FT-IR spektrai rodo sugerties juostas ties 3250 ir 1700 cm-1, kurios priskiriamos N-H bei C=N ryšių virpesiams. Šie ryšiai būdingi kristalinės formos EDC cikliniams tautomerams [22].

EDC-goood

12 pav. EDC struktūrinė formulė ir jo tautomerija [22]

Kondensacijos reakcijos metu EDC reaguoja su pirmos molekulės karboksigrupe, susidarant tarpiniam O-acilizourėjos produktui, kuris toliau reaguoja su aminais (13 pav.).

karbodimidinis___rysys

13 pav. EDC veikimo mechanizmas [22]

O-acilizourėjai reaguojant su antros molekulės aminogrupe, susiformuoja stiprus amidinis ryšys. Be to, tarpinis produktas gali lengvai hidrolizuotis. Hidrolizės metu jis tampa nestabiliu ir suyra, susidarant pradinei karboksigrupei. Tarpinį O-acilizourėjos junginį stabilizuoja N-hidroksisulfongintaro rūgšties imido (sulfo-NHS) pridėjimas. Pridėjus sulfo-NHS, susidaro sulfo-NHS esteris, kuris yra pakankamai stabilus ir gali dalyvauti dviejų stadijų susiuvimo reakcijose [22].

Chitozano modifikavimas adipo, vyno ir citrinų rūgštimis buvo vykdomas vandeninėje terpėje (pH 6,5), reakciją vykdant kambario temperatūroje 24 val. Pasibaigus reakcijai, reakcijos mišinys 72 val. dializuojamas vandenyje, naudojant Visking (SERVA, MWCO 12 000-14 000) dializės žarną. Jos metu, esant skirtingoms koncentracijoms membranoje bei cilindre, dėl difuzijos mažamolekuliai junginiai difunduoja į mažesnės koncentracijos aplinką. Tokiu būdu produktas gryninamas nuo nesuregavusių mažamolekulių karboksirūgščių bei karbodiimido liekanų. Siekiant pagerinti tirpumą ir norint išvengti didesnio susisiuvimo, produktas džiovinamas liofilizuojant. Gaunama puri, akyta medžiaga, puikiai tinkanti tolesnėms sintezėms.

Nanodalelės buvo susintetintos naudojant įvairius chitozano ir karboksirūgščių santykius. Norint išvengti didelio dalelių susiuvimo laipsnio, kuris junginį gali paversti į netirpų, tankiai susiūtą gelį, bei planuojant nanodaleles toliau dar modifikuoti per likusias laisvas chitozano aminogrupes, sintezei buvo naudojami mažesni karboksirūgščių moliniai kiekiai (reakcijos terpėje sukuriant aminogrupių perteklių). Buvo naudotas perteklinis EDC kiekis, kadangi žinoma, kad jo reikia dvigubai ar trigubai daugiau negu yra karboksigrupių. Prikausomai nuo rūgšties, aminogrupių kiekis karboksigrupių atžvilgiu sudarė nuo 15 iki 70 %. Sintezės rezultatai parodė, kad didinant santykinį karboksirūgščių kiekį, chitozano pakeitimo laipsnis didėja. Karboksirūgštimis N-modifikuotų chitozano darinių išeiga siekė 63-88 %. Didžiausias chitozano pakeitimo laipsnis (PL) buvo pasiektas naudojant CHZ-CR3 (PL 26 %) (1 lentelė).

1 lentelė. Chitozano modifikavimo karboksirūgštimis  rezultatai

Nr.

Karboksirūgštis

Junginys

Mol. sant.

Chz:rūgštis

(-NH2):(-COOH) sant.

PL %

η, %

[η], dL/g

1

Adipo r.

CHZ-AR1

1:0,10

1:0,20

10

77

3,12

CHZ-AR2

1:0,18

1:0,36

15

80

-

CHZ-AR3

1:0,23

1:0,46

19

45

3,24

2

Vyno r.

CHZ-VR1

1:0,18

1:0,50

22

4,07

CHZ-VR2

1:0,25

1:0,70




24

4,26

3

Citrinų r.

CHZ-CR1

1:0,05

1:0,15

7

63

3,45

CHZ-CR2

1:0,10

1:0,30

17

88

2,44

CHZ-CR3

1:0,20

1:0,60

26*

95

-

* - chitozano PL apskaičiuotas iš azoto kiekio

Susintetinti chitozano N-modifikuoti dariniai buvo identifikuoti FT-IR ir 1H-BMR spektroskopiniais metodais. Adipo rūgštimi modifikuoto chitozano 1H-BMR spektre D2O/acto rūgštyje-d4 matyti chitozanui ir karboksirūgščiai būdingi signalai.

14 pav. Chitozano (1) ir CHZ-AR (PL 10 %) (2) (D2O/acto rūgštis-d4) 1H BMR spektrai

Kaip matyti 14 pav., N-modifikuotame darinyje atsiranda nauji, chitozanui nebūdingi signalai ties 1,44 ir 2,25 p.pm. Cheminis poslinkis ties 1,44 p.pm. priskiriamas adipo rūgšties alifatinės grandinės metileno grupių –(CH2)2- protonams. Tuo tarpu signalas ties 2,25 p.pm. priskiriamas adipo rūgšties metilgrupių, esančių prie karboksigrupių, protonams. Lyginant chitozano protono ties antruoju anglies atomu (2,97 p.pm.) signalo intensyvumą su minėtų protonų, esančių modifikuojančios rūgšties liekanoje, signalų intensyvumu, buvo apskaičiuotas chitozano pakeitimo laipsnis. Chitozano pakeitimo laipsnis jo dariniuose kinta nuo 7 iki 26 % (1 lentelė). Esant mažam chitozano pakeitimo di- ir trikarboksirūgštimis laipsniui (PL 7-22 %), gauti vandeninėje terpėje tirpūs kopolimerai, tačiau kai PL 26 % ir daugiau, gauti dariniai vandeninėje terpėje netirpsta.

Buvo nustatytas tirpių chitozano darinių ribinis klampos skaičius. Chitozano modifikavimo di- ir trikarboksirūgštimis produktų ribinis klampos skaičius [η] mažesnis negu pradinio chitozano ir priklausomai nuo PL kinta nuo 2,44 iki 4,26 dL/g (1 lentelė). Ribinio klampos skaičiaus vertės sumažėjimas chitozaną dalinai tinklinant yra laukiamas, kadangi susidarančių šakotų makromolekulių tankis yra didesnis, o jų hidrodinaminis spindulys mažesnis.

Apie sėkmingą chitozano N-modifikavimo karboksirūgštimi reakciją galima spręsti ir iš FT-IR spektrų. Lyginant chitozano ir adipo rūgštimi modifikuoto chitozano (PL 10 %) FT-IR spektrus matyti, kad modifikuoto darinio spektre padidėja sugerties juosta ties 1407 cm-1, priskiriama adipo rūgšties alifatinei grandinei (15 pav.).

15 pav. Chitozano (1) ir CHZ-AR (PL 10 %) (2) FT-IR spektrai

Buvo ištirtos susintetintų chitozano darinių molekulinės masės molekulinių sietų chromatografija (MSC). Tyrimo metu naudota triguba detekcija, kurią sudarė šviesos sklaidos, lūžio rodiklio bei klampos detektoriai.

Junginių MSC rezultatai pateikti 2 lentelėje. Kaip matyti, N-modifikuotų chitozano darinių masinė molekulinė masė mažesnė negu pradinio chitozano. Galimos to priežastys – dalinis medžiagų praradimas filtravimo metu, arba dalinė polimero adsorbcija kolonėlėje. Visų bandinių eliuavimo kreivės RI jutiklio atžvilgiu buvo bimodalinės, o šviesos sklaidos jutiklio atžvilgiu – unimodalinės ir pasislinkusios mažesnio eliuavimo tūrio kryptimi (16 pav.). Didelės molekulinės masės (mažesnio eliuavimo tūrio) frakcija priskirtina dalinai tinklinto chitozano makromolekulėms. Mažamolekulės frakcijos, fiksuojamos tik lūžio rodiklio jutikliu, signalo kilmė neaiški.

5 pav. CHZ-AR3 (PL 19 %) MSC eliucijos kreivės. Detektuota su šviesos sklaidos (LS) ir lūžio rodiklio (RI) jutikliais

Viena iš svarbiausių nanodalelių charakteristikų yra jų dydžio įvertinimas. Taigi, susintetintos nanodalelės buvo ištirtos dinaminės šviesos sklaidos (DLS) metodu.

Ištyrus daleles DLS metodu nustatyta, kad joms būdingas bimodalinis pasiskirstymas (17 pav.). Nanodalelių hidrodinaminis spindulys priklauso nuo sintezei naudotos di(tri)karboksirūgšties ir siekia 230-850 nm (3 lentelė). Šalia nanodalelių yra ir chitozano (ar modifikuoto chitozano) makromolekulių, kurių hidrodinaminis spindulys 10-55 nm.

2 lentelė. MSC metodu nustatytos molekulinės masės

Junginys

PL, %

Mn

Mw

Mw/Mn

[η]*, dL/g

CHZ

-

311 000

456 000

1,47

3,71

CHZ-AD

10

135 900

293 500

2,27

2,12

15

219 200

502 400

1,83

2,42

CHZ-VR

22

79 930

189 100

2,37

2,36

24

76 710

154 300

1,97

-

CHZ-CR

7

144 600

288 700

1,28

1,71

17

199 900

434 100

3,063

1,69

17 pav. CHZ-AR (PL 19%) koreliacijos funkcija (kairėje) ir makromolekulių ir nanodalelių hidrodinaminių spindulių pasiskirstymo kreivės (dešinėje)

Chitozanas yra gamtinis katijoninis polimeras, turintis laisvų aminogrupių, kurios gali protonizuotis. Sintetinant nanodaleles, prie chitozano gali prisijungti ne visos reaktingos karboksigrupės, t.y., dalis karboksigrupių gali likti laisvų, galinčių jonizuotis. Dėl šios priežasties buvo tiriama, ar chitozano modifikavimo di- ir trikarboksirūgštimis produktai pasižymi poliamfolitams būdingomis savybėmis. Vienas iš būdų tai padaryti – potenciometrinis titravimas, kurio metu galima nustatyti poliamfolitų rūgštines ir bazines savybes.

Potenciometriškai titruojant chitozano darinių vandeninius tirpalus, esant pastoviai joninei jėgai (0,1 M NaCl), buvo gautos du perlinkius turinčios titravimo kreivės (18 pav.). Pirmajame perlinkio taške (pH apie 4-6) pilnai neutralizuojamas HCl ir karboksigrupės, o antrajame (pH apie 8-10) – protonizuojamos aminogrupės.

3 lentelė. Hidrodinaminiai nanodalelių spinduliai, nm

Nr.

Junginys

Intensyvumas

Rh, nm

 

11

CHZ-AD (PL 10 %)

0,062

0,855

10,5

849

2

CHZ-AD (PL 15  %)

0,230

0,768

10,6

395

33

CHZ-VR (PL 24 %)

0,021

0,923

55

633

3

44

CHZ-VR (PL 22 %)

0,020

0,785

24,9

564

55

CHZ-CR (PL 7 %)

0,155

0,830

10,2

232

66

CHZ-CR (PL 17 %)

0,118

0,491

16,1

323

18 pav. CHZ-CR (PL 17%) (1), CHZ-VR (PL 22%) (2) ir CHZ-AR (PL 15%) (3) potenciometrinio titravimo kreivės

Iš chitozano darinių titravimo kreivių (18 pav.) buvo rasti ekvivalentiniai taškai bei apskaičiuoti polielektrolitų jonizacijos laipsniai kiekvienam potenciometrinės kreivės taškui. Potenciometrinio titravimo duomenis pateikus Hendersono-Hazelbalcho lygties koordinatėse (19 pav.), buvo įvertintos chitozano pKα vertės šiuose dariniuose (4 lentelė). Chitozano pKa vertė 6,3 [2], o rastos pKa vertės jo dariniuose yra nuo 6,64 iki 7,65. Didžiausia pKa vertė (7,65) yra chitozano darinyje CHZ-CR (PL 17%), kuriame aminogrupių kiekis mažiausias (2,22 %), o mažiausia pKa vertė (6,64) chitozano darinyje CHZ-AR (PL 15%), kuriame aminogrupių kiekis didžiausias (6,16 %). Vadinasi, lyginant su pradiniu chitozanu, chitozano darinių pKa verčių didėjimas bei laisvų aminogrupių kiekio mažėjimas leidžia daryti išvadą, kad sėkmingai įvyko reakcija.



19 pav. CHZ-N-AD (1:0,23) potenciometrinio titravimo duomenys, pateikti Hendersono – Hazelbalcho lygties koordinatėse

4 lentelė. Potenciometrinio titravimo rezultatai

Nr.

Chitozano darinys

-NH2, %

pKa

COOH*, %

1

CHZ-AR (PL 15%)

6,16

6,64

-

2

CHZ-VR (PL 8%)

3,92

6,84

8,94

3

CHZ-VR (PL 22%)

3,21

6,94

5,81

4

CHZ-CR (PL 17%)

2,22

7,65

-

CCOOH* - karboksigrupių kiekis nustatytas iš cheminės analizės duomenų

Norint įsitikinti, kad karboksirūgštimis modifikuoti chitozano dariniai pasižymi polielektrolitams būdingomis savybėmis, buvo mėginta nustatyti izoelektrinį tašką. Kaip matyti iš 20 pav., didinant pH, savitoji klampa pastoviai mažėjo. Pastebėta, kad esant pH » 7 tirpalas darėsi balzganas, t.y. prasidėjo makromolekulių aglomeracija ir dalelių agregacija. Taigi, dėl blogo chitozano darinio tirpumo šarminėje terpėje izoelektrinio taško nustatyti negalėjome. Tačiau yra žinoma [24], kad amfoterinį polimerą potenciometriškai titruojant vandenyje ir druskos tirpale, titravimo kreivės kertasi taške, kuris labai artimas izoelektriniam taškui. Titruojant chitozano-N-AR (PL 10 %) darinį, titravimo kreivės kertasi ties pH 6,5. Remiantis šia teorija galima teigti, kad gautos dalelės pasižymi poliamfolitams būdingomis savybėmis.

20 pav. CHZ-AR (PL 10 %) savitosios klampos priklausomybė nuo pH 0,03 M HCl (2) ir 0,03 M HCl/0,1 M NaCl tirpale (1)

3.2      Nanodalelių panaudojimas RAFT polimerizacijoje

Susintetintos nanodalelės buvo naudojamos RAFT makroiniciatorių sintezei. Prie jų prijungti du skirtingi grandinės perdavos agentai (GPA) (4-cianpentano rūgšties)-4-ditiobenzenkarboksilatas (CPAD) ir 4-ciano-4[(dodecilsulfaniltiokarbonil)sulfanil]pentano rūgštis (TTR), taip gaunant makroiniciatorius. Po to, vykdant RAFT polimerizaciją ir naudojant iniciatorių ACPR, chitozano nanodalelės buvo “aprengtos” polihidroksietilmetakrilato (pHEMA) sluoksniu.

Vienas iš svarbiausių etapų vykdant RAFT polimerizaciją - tinkamas GPA pasirinkimas. RAFT agentas turi tiokabonilgrupę (S=C-S) bei du skirtingus pakaitus R ir Z, kurie lemia polimerizacijos kinetiką bei kontroliuoja struktūrą (21 pav.).

RAFT-STRUCTURE

21 pav. GPA struktūra [24]

Priklausomai nuo esančių R ir Z pakaitų kinta RAFT agento tirpumas bei reaktingumas. Agentus sudaro trys pagrindinės klasės: ditiobenzoatai, tritiokarbonatai, ditiokarbamidai.

Vienas iš mūsų pasirinktų GPA buvo CPAD (22 pav.). Jis naudojamas vykdant daugelio monomerų (stireno, akrilatų, metakrilatų) RAFT polimerizaciją. HEMA taip pat yra metakrilatas.  

cpad    untitled

22 pav. Grandinės perdavos agentas CPAD (kairėje) ir iniciatorius ACPR (dešinėje)

CPAD puikiai kontroliuoja polimero molekulinę masę, išlaiko mažą polidispersiškumą. Šis agentas taikomas įvairiose reakcijos terpėse – tirpaluose, suspensijose, emulsijose. CPAD gali būti gryninamas perkristalinant. Svarbiausias CPAD privalumas – jį galima naudoti vandeniniuose tirpaluose, kuriuose taip pat tirpios ir mūsų susintetintos nanodalelės. Šis GPA savo Z pakaite turi fenilgrupę, o R – 4-cianpentano rūgštį. Kai R grupė yra pašalinama, susidaręs radikalas yra identiškas iniciatoriaus 4,4’-azo-bis-(4-cianopentano rūgšties) (ACPR) radikalui (22 pav.).

Apie sėkmingą CPAD prijungimą prie nanodalelių galime spręsti iš 1H BMR spektrų. CHZ-N-AR-N-CPAD 1H BMR spektre be chitozano ir adipo rūgšties signalų atsiranda ir labai silpni CPAD protonams būdingi signalai 1,8-2,5 m.d. srityje (23 pav.). Rūgštinėje terpėje CHZ-N-AR-N-CPAD dariniai įgauna tokią konformaciją, kad hidrofobinės CPAD liekanos „paslepiamos“ makromolekulių viduje, todėl CPAD arilgrupės protonų signalas arba nematomas, arba labai silpnas. Spektre gerai matomas CPAD metilgrupės protonų signalas ties 1,92 m. d., todėl lyginant šio signalo ir chitozano H-2 protono (2,97 m. d.) signalo intensyvumus buvo apskaičiuotas chitozano PL jo dariniuose su CPAD.

23 pav. CHZ-N-AR (PL 10%) (1) (D2O/acto rūgštis-d4), CPAD (CDCl3) (2) ir CHZ-N-AR (PL 10%)-N-CPAD (PL 12%) (D2O/acto rūgštis-d4) (3) 1H BMR spektrai

Susintetintas RAFT makroiniciatosius CHZ-AR (PL 10%)-CPAD (PL 12%) buvo ištirtas MSC ir DLS metodais (24 pav.). Nustatyta jo vidutinė masinė molekulinė masė Mw = 111 400 yra mažesnė už pradinės nanodalelės (5 lentelė). Tai galima būtų paaiškinti dalies polimero praradimu filtracijos metu. Dinaminės šviesos sklaidos rezultatai parodė, kad dalelių pasiskirstymas yra bimodalinis . Susintetintų nanodalelių dydis siekė 133 nm (6 lentelė).

24 pav. MSC eliucijos kreivės (kairėje) (detektuota su šviesos sklaidos (LS) ir lūžio rodiklio (RI) jutikliais) bei makromolekulių ir nanodalelių hidrodinaminių spindulių pasiskirstymo kreivės (dešinėje)

5 lentelė. Junginio CHZ-AR (PL 10%)-CPAD (PL 12%) DLS rezultatai

Intensyvumas

Rh, nm

0,096

6,74

0,903

133

CHZ-AR (PL 10 %) buvo modifikuotas ir kitu hidrofiliniu GPA agentu – 4-ciano-4-(dodecilsulfaniltiokarbonil) sulfanilpentano rūgštimi TTR (25 pav.).

25 pav. 1H-BMR spektrai CHZ-AR (PL 10 %) (1), CHZ-AR (PL 10 %)-TTR (2)

Susintetinti RAFT makroiniciatoriai buvo panaudoti RAFT polimerizacijai valdyti (26 pav.). Kadangi reakcija vykdyta vandeninėje terpėje, tai iniciatoriumi buvo naudotas ACPR, nes jis tirpus vandeniame tirpale, ko negalima pasakyti apie AIBN. Sintezės metu siekta susintetinti hidrofilines nanodaleles, todėl pasirinktas monomeras HEMA. Jis yra hidrofilinis kaip ir chitozanas. Be to, šis monomeras gerina sintetinamų produktų adheziją prie substratų.

26 pav. RAFT makroiniciatoriaus sintezė bei HEMA RAFT polimerizacija

Apie tai, kad HEMA polimerizacija vyko galima spręsti iš 1H BMR spektrų (27 pav.): atsiradęs signalas ties 4,15 m.d. yra būdingas HEMA esančios –CH2-O-C(=O)-R grupės protonams.

27 pav. CHZ-AR (PL 10 %) (1), CHZ-AR (PL 10 %)-CPAD (PL 12 %) (2) ir CHZ-AR (PL 10 %)-CPAD (PL 12 %)-PHEMA (3)  1H-BMR spektrai


IŠVADOS

l     Iš chitozano ir dikarboksirūgščių karbodiimidiniu metodu susintetintos vandeniniuose tirpaluose tirpios chitozano nanodalelės, kuriose chitozano pakeitimo laipsnis kinta nuo 7 iki 22 %.

l     DLS metodu nustatyta, kad susintetintų nanodalelių hidrodinaminis spindulys Rh kinta nuo 230 iki 850 nm. Greta nanodalelių yra ir modifikuoto chitozano makromolekulių, kurių Rh kinta nuo 7 iki 25 nm.

l     Prie chitozano ir karboksirūgštimis modifikuotų chitozano nanodalelių prijungus (4-cianpentano rūgšties)-4-ditiobenzenkarboksilatą (CPAD) arba 4-ciano-4-(dodecilsulfaniltiokarbonil) sulfanilpentano rūgštį (TTR), susintetinti makroiniciatoriai gyvybingajai radikalinei polimerizacijai RAFT metodu.

l     Grįžtamosios jungimosi-fragmentacijos grandinės perdavos (RAFT) polimerizacijos metodu chitozano nanodalelės “aprengtos” polihidroksietil metakrilato sluoksniu.


VILNIUS UNIVERSITY

FACULTY OF CHEMISTRY

DEPARTMENT OF POLYMER CHEMISTRY

Synthesis and study of chitosan-based nanoparticles

                                                                       

SUMARRY

In recent studies, a huge attention is paid to natural polymer chitosan and its application in medicine as drug or gene carrier.

Chitosan is produced from chitin – the second most popular biopolymer – by deacetylation reaction. The most important chitosan properties are nontoxicity, biodegradability and facile modification through amine group. The present work deals with the synthesis of chitosan-based nanoparticles via carbodiimide induced coupling between amino groups of chitosan and carboxyl groups of di- and trifunctional acids resulting in amide linkages. The synthesized chitosan derivatives were characterized by FT-IR and 1H-NMR spectroscopy and solution viscometry. Molecular weight of the copolymers was determined by gel permeation chromatography, and the size of nanoparticles was measured by dynamic light scattering. The size distribution of the modified chitosan was bimodal suggesting hydrodynamic radius of the nanoparticles in the range from 170 to 850 nm and that of separate macromolecules in the range 10 to 55 nm.

Further, chitosan nanoparticles were modified with RAFT chain transfer agents (CTA) CPAD and TTR resulting in macro-CTA. RAFT polymerization of the hydrophilic monomer HEMA in the presence of chitosan nanoparticles as macro-CTA resulted in hydrophilic nanoparticles which can be used in bionanotechnology and biomedicine.


LITERATŪROS SĄRAŠAS:

1.      Nalwa H. S., Polymeric nanostructures and their applications. Los Angeles:American Scientific Publishers, 2007.

2.      Crini G. , Badot P.-M. Application of chitosan, a natural aminopolysaccharide, for dye removal from aqueous solutions by adsorption processes using batch studies: A review of recent literature. Progress in Polymer Science, 2008, 33 (4), p. 399-447.

3.      Speičienė V., Sekmokienė D. Chitozanas ir jo pritaikymas maisto pramonėje (apžvalga). Maisto chemija ir technologija, 2005, 39 (1), p. 68-72.

4.      Kean T, Roth S, Thanou M. Trimethylated chitosans as non-viral gene delivery vectors: cytotoxicity and transfection efficiency. J Control Release, 2005, 103 (3), p. 643–53.

5.      Mark H. F. Encyclopedia of Polymer Science and Technology, 3rd ed. USA: John Wiley and Sons Inc., 2003.

6.      Chen P.H, Kuo T.Y., Liu F.H., Hwang Y.H., Ho M.H., Wang D.M., Lai J.Y., Hsieh H.J. Use of dicarboxylic acids to improve and diversify the material properties of porous chitosan membranes. J. Agric. Food Chem., 2008, 56, p. 9015-9021.

7.      Schwartz M. Smart Materials. CRS press, Taylor and Francis group, 2009.

8.      Aranaz I., Harris R., Heras A. Chitosan amphiphilic derivatives. Chemistry and applications. Current Organic Chemistry, 2010, 14, p. 308-330.

9.      Stuart b. H. Polymer analysis. John Wiley and Sons Inc., 2003.

10.   Braun D., Cherdron H., Ritter H.. Polymer synthesis: theory and practice. Fundamentals, methods, experiments, 3rd ed. Germany: Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2001.

11.   Christian P., Kammer F.; Baalousha M., Hofmann Th. Nanoparticles: structure, properties, preparation and behaviour in environmental media. Ecotoxicology, 2008, 17, p. 326-343.

12.   Bouwmeester H., Dekkers S., Noordam M. Y., Hagens W. I., Bulder A. S., Heer C., Voorde S., Wijnhoven A. W.P., Marvin H. J.P.,. Sips A. J.A.M. Review of health safety aspects of nanotechnologies in food production. Regulatory Toxicology and Pharmacology, 2009, 53 (1), p.52-62.

13.   Silva G. A., Ducheyne P., Reis R. L. Materials in particulate form for tissue engineering. 1. Basic concepts. J. Tissue Eng. Regen. Med, 2007, 1, p. 4-24.

14.   Gaucher G., Marchessault R. H., Leroux J.C. Polyester-based micelles and nanoparticles for the parenteral delivery of taxanes. Journal of Controlled Release, 2010, 143 (1), p. 2-12.

15.   Zonghua L., Yanpeng J., Yifei W., Changren Z., Ziyong Z.. Polysaccharides-based nanoparticles as drug delivery systems.Advanced Drug Delivery Reviews, 2008, 60, p. 1650-1662.

16.   Bodnar M., Hartmann J.F., Borbely J.. Preparation and characterization of chitosan-based nanoparticles. Biomacromolecules, 2005, 6, p. 2521-2527.

17.   http://en.wikipedia.org/wiki. Raktiniai žodžiai: Carbodiimide, Dicyclohexylcarbo diimide, N,N-Diisopropylcarbodiimide, 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide. Žiūrėta: 2010 03 12.

18.   Berger J., Reist M., Mayer J. M., Felt O., Peppas N. A., Gurny R. Structure and interactions in covalently and ionically crosslinked chitosan hydrogels for biomedical applications. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 2004, 57 (1), p. 19-34.

19.   York A. W., Kirkland S. E., McCormick C. L. Advances in the synthesis of amphiphilic block copolymers via RAFT polymerization: Stimuli-responsive drug and gene delivery. Advanced Drug Delivery Reviews, 2008, 60, p. 1018–1036.

20.   Perrier, S., Takolpuckdee, P. Macromolecular design via reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT)/xanthates (MADIX) polymerization. Journal of Polymer Science: Part A: Polymer Chemistry, 2005, 43, p. 5347-5393.

21.   Boyer C., Bulmus V., Davis T. P., Ladmiral V., Liu J., Perrier S. Bioapplications of RAFT Polymerization. Chem. Rev., 2009, 109, p. 5402–5436.

22.   Leidinys internete: http://www.actim.com/content/view/25/38/lang,en/. Žiūrėta: 2010 03 15.

23.   Pottorf R. S., Szeto P., 1-Ethyl-3-(3′-dimethylaminopropyl)carbodiimide Hydrochloride. 2001 04. Adresas: http://www.mrw.interscience.wiley.com/eros/articles/re062/ frame.html. Žiūrėta: 2010 03

24.   Alfrey, T., Fuoss, R. M., Morawetz, H., Pinner, H. Amphoteric Polyelectrolytes. II. Copolymers of Methacrylic Acid and Diethylaminoethyl Methacrylate. Journal of the American Chemical Society, 1952, 74, p. 438-441

25.   Leidinys internete: http://www.strem.com/uploads/resources/documents/raft.pdf. Žiūrėta: 2010 04 20.



[1] Ofortas - tai grafikos technika, spaudos būdas, išrastas XVII a. Būdinga šviesių-tamsių tonų deriniai, subtilus štrichavimas, laisvas piešinys.

[2] NIPAAm – N-izopropilakrilamidas








Politica de confidentialitate

DISTRIBUIE DOCUMENTUL

Comentarii


Vizualizari: 1873
Importanta: rank

Comenteaza documentul:

Te rugam sa te autentifici sau sa iti faci cont pentru a putea comenta

Creaza cont nou

Termeni si conditii de utilizare | Contact
© SCRIGROUP 2019 . All rights reserved

Distribuie URL

Adauga cod HTML in site