CATEGORII DOCUMENTE
Afaceri Calculatoare Casa masina Didactica pedagogie Diverse Educatie Finante Geografie Istorie & politica Legislatie Limba Management Sanatate Tehnologie

Bulgara	Ceha slovaca	Croata	Engleza	Estona	Finlandeza	Franceza
Germana	Italiana	Letona	Lituaniana	Maghiara	Olandeza	Poloneza
Sarba	Slovena	Spaniola	Suedeza	Turca	Ucraineana

įstatymai	įvairių	Apskaitos	Architektūra	Biografija	Biologija	Botanika	Chemija
Ekologija	Ekonomika	Elektra	Finansai	Fizinis	Geografija	Istorija	Karjeros
Kompiuteriai	Kultūra	Literatūra	Matematika	Medicina	Politika	Prekyba	Psichologija
Receptus	Sociologija	Technika	Teisė	Turizmas	Valdymas	vietimas

Chitozano nanodaleliŲ sintezĖ ir tyrimas - bakalauro studijų baigiamasis darbas

chemija

+ Font mai mare | - Font mai mic


DOCUMENTE SIMILARE

VILNIAUS UNIVERSITETAS

CHEMIJOS FAKULTETAS

POLIMERŲ KATEDRA

Lina Pukaitė

Pagrindinių studijų programa Chemija – 4 kursas

Chitozano nanodalelių sintezė ir tyrimas

Bakalauro studijų baigiamasis darbas

SANTRUMPOS

AR – adipo rūgtis

CPAD - (4-cianpentano rūgties)-4-ditiobenzenkarboksilatas

CR – citrinų rūgtis

DL – deacetilinimo laipsnis

DLS – dinaminė viesos sklaida

FT-IR – infraraudonoji spektroskopija

GPA – grandinės perdavos agentas

H-BMR – protonų magnetinis rezonansas

HEMA - 2-hidroksietilmetakrilatas

MSC – molekulinių sietų chromatografija

PL – pakeitimo laipsnis

RAFT - grį˛tamoji jungimosi–fragmentacijos grandinės perdavos polimerizacija

T_lyd – junginio lydymosi temperatūra

T_stik – polimero stiklėjimo temperatūra

TTR - 4-Ciano-4[(dodecilsulfaniltiokarbonil)sulfanil]pentano rūgtis

VR – vyno rūgtis

ĮVADAS

Chitozanas – tai linijinis, katijoninis, hidrofilinis aminopolisacharidas, gaunamas i plačiai gamtoje randamo chitino. Palyginus su chitinu ar celiulioze - chitozanas lengviau chemikai modifikuojamas, yra tirpus parūgtintuose tirpaluose. Taip pat pasi˛ymi puikiomis biologinėmis savybėmis: yra netoksikas, biosuyrantis, jam būdingas antibakterinis aktyvumas, biolipnumas. Minėtos chitozano savybės ir palyginus nedideli polimero gavimo katai stiprina domėjimąsi juo.

Viena i chitozano pritaikymo sričių – farmacija, kur polimeras bandomas panaudoti vaistų pernaai. Tai padaryti galima susintetinus chitozano nanodaleles, o biologikai aktyvias med˛iagas itirpinant, įkapsuliuojant, adsorbuojant, imobilizuojant ar prijungti prie nanodalelės. Priklausomai nuo parinkto metodo bus gaunamos nanodalelės, nanosferos arba nanokapsulės.

Nanodalelės yra pranaesnės u˛ kitas daleles (netgi mikrodales) savo dideliu paviriaus plotu lyginant su tūriu. Dėl ios prie˛asties atsiveria įvairi paviriaus modifikavimo galimybė. Taip pat nanodalelės gali būti funkcionalizuojamos - prie paviriaus prikabinamos atitinkamos funkcinės grupės (pvz., trumpagrand˛iai peptidai), kurios jau gali sąveikauti su biologinėmis sistemomis. Dar vienas svarbus aspektas – jų dydis, siekiantis 200 nm. Tai nanodalelėms leid˛ia efektyviau judėti bei greičiau pasiekti tikslą. Kita nanodalelių charakteristika - molekulinė masė. Kuo didesnė polimero molekulinė masė – tuo vaistas bus paleistas lėčiau. Nanodalelių stabilizavimas paremtas atostūmio jėgomis tarp krūvį turinčių dalelių arba erdviniais faktoriais.

Dėl pastebėto chitozano nanodalelių suderinamumo su biomolekulėmis ir jų unikalių savybių pagrindinis mūsų darbo tikslas ir buvo susintetinti ir itirti chitozano nanodaleles.

U˛daviniai:

Susintetinti chitozano nanodaleles, chitozaną modifikuojant di- ir trikarboksirūgtimis karbodiimidiniu metodu;
Chitozano nanodalelių pavirių modifikuojant CPAD bei TTR, susintetinti RAFT makroagentus;
Chitozano nanodaleles “aprengti” polihidroksietil-metakrilato (pHEMA) sluoksniu grį˛tamosios jungimosi-fragmentacijos grandinės perdavos (RAFT) polimerizacijos metodu.

LITERATŪROS APˇVALGA

Chitozanas

Chitozano savybės

Chitozanas – tai linijinis, hidrofilinis aminopolisacharidas. Polimeras gaunamas chitino, vieno gausiausiai randamo gamtinio polisacharido, arminio deacetilinimo metu (1 pav.). Kai yra deacetilinta daugiau kaip 50 % chitino acetatinių grupių, med˛iaga vadinama chitozanu. Deacetilinimo laipsnis (DL) komerciniame chitozane svyruoja nuo 60 iki 100 %. Chitino molekulinė masė siekia keletą milijonų, o komercikai parduodamo chitozano molekulinė masė, priklausomai nuo DL, gali būti nuo keliasdeimt tūkstančių iki kelių milijonų [1-6].

1 pav. Chitozano gavimo schema [6]

Chitozaną sudaro D-gliukozamino grandys. Polimeras turi vieną pirminę amino ir dvi hidroksigrupes ties trečiuoju ir etuoju anglies atomais. Dėl laisvos aminogrupės chitozanas turi teigiamą krūvį ir dėl ios savybės polimeras reaguoja su neigiamą krūvį turinčiais paviriais ar polimerais. Be to, gali sudaryti chelatus su metalų jonais, ypač kobaltu, bei koordinacinius pereinamųjų metalų kompleksus, kurių stabilumas didėja tokia tvarka: Mn<Fe<C<Ni<Cu<Zn. Tokie kompleksai gali būti naudojami kaip metalų jonų absorbentai, todėl neretai pritaikomi metalams atskirti.Chitozanas taip pat gali formuoti tarpmolekulinius vandenilinius ryius ir jo tirpalai yra klampūs [1, 2, 7].

Cheminiu po˛iūriu chitozanas yra silpna bazė, todėl deprotanizavus aminogrupę tampa puikiu nukleofilu (pK_a 6,3). Polimeras yra tirpus parūgtintuose praskiestuose vandeniniuose tirpaluose [2] (pH < 6,5), kur gliukozamino grandys virsta į tirpią formą R-NH₃⁺. arminiuose ar turinčiuose polianijonų tirpaluose chitozanas ikrenta į nuosėdas ir esant ˛emesnėms pH vertėms sudaro gelius [1]. Visikai netirpsta organiniuose tirpikliuose bei vandenyje. Gausus reaktingų grupių skaičius leid˛ia chitozaną chemikai modifikuoti bei naudoti susiuvimo reakcijose. Organinėse ir neorganinėse rūgtyse polimeras sudaro druskas.

Chitozanas – tai katijoninis biopolimeras, turintis didelį krūvio tankį (gliukozamino liekanai tenka vienas teigiamas krūvis). Be to, yra geras koaguliantas – sąveikauja su neigiamą krūvį turinčiomis molekulėmis. Jam būdingas joninis laidumas, adsorbcinės savybės. Chitozanas tinkamas plėvelių formavimui ir biomolekulių izoliavimui, rūgtinėje terpėje pasi˛ymi polielektrolitams būdingomis savybėmis.

Polimerinių med˛iagų biologinės savybės ypač svarbios farmacijos srityje. Viena i chitozano savybių tyrimo prie˛asčių – bandymas jį panaudoti vaistų pernaai. Taigi, pagrindinės chitozano biologinės savybės yra ios:

biologinis suderinamumas – yra netoksikas, biodegraduojamas/biosuyrantis;

biologinis aktyvumas – būdingas antibakterinis ir antigrybinis aktyvumas. Chitozanas stabdo grybų, bakterijų, virusų augimą arba juos visai sunaikina. Jis taip pat pasi˛ymi rūgtingumą ma˛inančiomis, apsauginėmis savybėmis, o ma˛os molekulinės masės chitozanas stabdo vė˛inių ląstelių augimą. Be to, pastebėtas teigiamas chitozano poveikis ma˛inant riebalų ir cholesterolio kiekio įsisavinimą į gyvūnų bei ˛monių organizmą;

bioadhezinės savybės – biologinis sulipimas/biologiniai klijai, t.y., sintetinių ir biologinių makromolekulių sujungimas biologiniais tikslais [1, 2, 5].

Chitozano panaudojimas

Patrauklios chitozano savybės bei palyginus nedideli polimero gavimo katai lėmė didelį jo panaudojimo augimą. Chitino produkcija pasaulyje kiekvienais metais siekia 1×10¹³ kg [4]. iuo metu chitozano pritaikymas aprėpia daugybę sričių.

ˇemės ūkyje chitozanas naudojamas padidinti derliui, augalų apsaugai bei yra tinkamas dirvo˛emio apdirbimui. Biomedicinos srityje chitozanas naudojamas medicininių siūlų bei tvarsčių, kontaktinių lęių gamyboje. Be to, skatina audinių augimą, pasi˛ymi prievė˛inėmis savybėmis. Biotechnologijoje chitozanas puikiai tinka fermentų imobilizavimui, mikrokapsuliavimui, kartu su anijoniniais polimerais formuoja gelius bei kapsules. Taip pat labai svarbus chemijos pramonėje. Metalų chelatų sudarymo savybė pritaikoma vandens gryninimui. Beje, chitozano pritaikymas turi ir ekologinių aspektų, kad ir platus polimero pritaikymas nutekamųjų vandenų valymui ar biosuyrančių plėvelių, naudojamų pakavimui, gamyboje. Kosmetikos srityje chitozanas naudojamas gaminant losjonus, plaukų lakus, rankų ir kūno kremus, ampūnus. Dar viena svarbi sritis – maisto pramonė. Chitozanas dėl savo gebėjimo sudaryti gelį kartais naudojamas tiesiog siekiant pakeisti produkto tekstūrą. Chitozanas neleid˛ia maistui greitai sugesti, taip pat yra tinkamas dietinio maisto bei skaidulų gamybai, nes suria cholesterolį, riebiąsias rūgtis, monogliceridus. Polimeras yra puikus emulsiklis bei spalvos stabilizatorius. Vartojamas ir gyvūnų maisto prieduose. Tokioje srityje kaip farmacija puikiai tinka dermatologijos produktams. Dėl polimero netoksikumo, biosuderinamumo yra tinkamas ir vaistų ineiojimui organizme. Be jau paminėtų sričių, dėl antimikrobinių savybių chitozanas pritaikomas tekstilėje, popieriaus pramonėje, nes polimeras stiprus ir drėgnomis sąlygomis; stomatologijoje naudojamas dantų implantų gamyboje; fotografijoje pritaikomas popieriaus gamyboje [2, 5, 8].

Chitozano modifikavimo reakcijos ir darinių klasifikacija

Chitozanas savo chemine struktūra isiskiria i kitų polisacharidų. Jis turi tris skirtingas reaktingas grupes (kaip jau minėta anksčiau, pirminę aminogrupę ties antruoju anglies atomu, antrinę hidroksigrupę ties trečiuoju anglies atomu ir pirminę hidroksigrupę ties etuoju anglies atomu), o tai leid˛ia polimerą modifikuoti, ypač lengvai per aminogrupę. Prie chitozano galima prijungti eilę įvairių funkcinių grupių. Da˛niausiai pasitaikančios chitozano modifikavimo reakcijos yra karboksimetilinimas, acetilinimas, skiepijimas, o gauti dariniai yra skirstomi į keturias grupes: modifikuotas polimeras, susiūtasis chitozanas, kompozitai chitozano pagrindu ir membranos.

I. Modifikuotas polimeras:

o Karboksimetilchitozanas;

o Alkilintas chitozanas;

o Sulfatinio chitozano junginiai;

o akotieji chitozano junginiai, kur atakas sudaro angliavandeniliai;

o Skiepytieji chitozano junginiai;

o Chitozano-ligandų junginiai.

II. Susiūtasis chitozanas:

o Kovalentikai susiūtos dalelės;

o Jonikai susiūtos dalelės;

o Nanodalelės;

o Fiziniai geliai;

III. Kompozitai chitozano pagrindu:

o Chitozano – dendritų hibridai;

o Chitozanas, sustiprintas intertinėmis med˛iagomis – silikageliu, stiklo laeliais, aliuminiu.

IV. Membranos.

Viena chitozano darinių ataka yra susiūtieji chitozano junginiai. Jie gali būti gelių ar dalelių (mikrodalelių, mikrosferų, nanodalelių) pavidalo.

Hidrogeliai gali susiformuoti savaime polimerui kovalentikai susisiūnant. Susiuvimo agentai turi ma˛iausiai dvi reaktingas funkcines grupes, kurios leid˛ia formuoti tiltelius tarp polimero grand˛ių. Chitozano susiuvimui plačiai naudojami dialdehidai tokie kaip glutaro aldehidas, formaldehidas, taip pat epoksidai, izocianatai ir karboksirūgtys. Susiuvimo tankis labiausiai priklauso nuo agento koncentracijos. Be to, didesnis chitozano deacetilinimo laipsnis yra palankesnis, nes susiuvimo reakcijoms reikia laisvų amino grupių [2].

Susiuvimo reakcijų metu formuojami kovalentiniai ryiai tarp polimerų grand˛ių [9]. Kovalentikai bei erdvikai susiūtos polimerinės med˛iagos gali būti gautos paruotas makromolekules susiuvant ma˛amolekuliais reagentais arba susidarant tarpmolekuliniams ryiams tarp polimerinių grandinių. Priklausomai nuo reakcijos sąlygų, galima gauti kompaktines tinklines sistemas su apibrė˛ta porų struktūra. Pastarosios naudojamos jonų mainams ar kaip stacionari fazė MSC bei panaiose chromatografijose, taip pat kaip substratas peptidų ir oligonukleotidų sintezėje ar fermentams imobilizuoti [10].

Nuo susiuvimo laipsnio labai priklauso med˛iagos savybės. Nesusiūti ar nestipriai susiūti polimerai yra minktesni, lankstesni. Tuo tarpu didelio tinklinimo laipsnio polimerai – trapesni, kietesni. Kai kuriuos polimerus galima susiūti tiesiog naudojant ilumą ir/ar slėgį, kiti susiūnami cheminės reakcijos metu kambario temperatūroje [9].

Be cheminio susiuvimo, gali būti naudojamas ir fizikinis. Jis vyksta formuojant vandenilinius ryius, pvz., poliamiduose ar poliuretanuose. Fizikinis susiuvimas naudojamas kartu su kovalentiniu arba atskirai. Prieingai cheminiam kovalentiniam susiuvimui, fizikinis susiuvimas yra termikai grį˛tamas [10].

Nanodalelės

Nanodalelių ypatybės

Nanomokslas, nanotechnologija vis labiau populiarėja, o nanodalelėms skiriama vis daugiau dėmesio. Dedamos didelės pastangos siekiant jas pritaikyti įvairiose srityse: elektronikoje, medicinoje, tekstilėje, maisto pramonėje, ˛emdirbystėje, kosmetikoje ir kitur [11, 12].

Nanodalelė – tai ma˛a dalelė, kurios bent vienas matmuo yra ma˛esnis u˛ 200 nm. Iskirtinis nanodalelių privalumas – didelis jų paviriaus plotas, lyginant su tūriu [11]. Dėl ios savybės jos yra pranaesnės u˛ mikrodaleles [13]. Labai svarbi yra nanodalelių paviriaus chemija. Pavyzd˛iui, silicio nanodalelių vidus u˛pildytas SiO₂, bet cheminė paviriaus sudėtis bus kitokia – artimesnė formulei Si(O)_(2-X). Daugeliu atvejų tiksli paviriaus sudėtis susijusi su konkrečiu pritaikymu. Pavirius gali būti modifikuojamas metalų jonais, ma˛omis molekulėmis, pavirinio aktyvumo med˛iagomis ar polimerais. Nanodalelės, sąveikaujančios su biologinėmis sistemomis, turi prie paviriaus prikabintas atitinkamas funkcines grupes (pvz., trumpagrand˛ius peptidus). [11]. Nanodalelių sistemose biologikai aktyvios med˛iagos (agentai) gali būti itirpintos, įkapsuliuotos, adsorbuotos, imobilizuotos ar prijungtos prie matricos. Priklausomai nuo parinkto metodo gaunamos nanodalelės, nanosferos arba nanokapsulės (2 pav.).

2 pav. Polimerinė nanosfera (a) ir nanokapsulė (b) [12]

Nanokapsulės – tai „pūslelinės“ sistemos, kuriose biologikai aktyvi med˛iaga yra laikoma ertmėje, apsuptoje unikaliu polimeriniu apvalkalu. Tuo tarpu nanosferos yra matricinės sistemos, kuriose med˛iaga yra fizikai tolygiai pasklidusi. Abi sistemos morfologikai ekvivalenčios mikrosferoms bei mikrokapsulėms. Nanodalelės (3 pav.) naudojamos vakcinoms – injekuotos/įvirktos jos gali cirkuliuoti kraujo sistemoje. Naudojamos vė˛inių susirgimų gydymui, padidina bioaktyvių baltymų stabilumą bei turi geresnes vaistų atpalaidavimo savybes [13].

3 pav. Polimerinė nanodalelė, naudojama vaistų pernaai [14]

Nanodalelės yra ma˛os, joms būdingas Brauno judėjimas, todėl tokios dalelės turėtų formuoti stabilias dispersijas. Deja, dėl didelės nanodalelių paviriaus energijos bet koks dviejų dalelių susidūrimas tirpale sukelia aglomeraciją, ir nanodalelės ikrenta į nuosėdas. Dispersiją svarbu stabilizuoti ilaikant atstumą tarp dalelių. Stabilizavimas paremtas atostūmio jėgomis tarp krūvį turinčių dalelių arba erdviniais faktoriais.

Stabilizavimas krūviais galimas tada, kai nanodalelių paviriuje yra asocijuotų krūvių. Be to, prie dalelės paviriaus yra tvirtai prisijungusių tirpiklio molekulių, ir tai formuoja vadinamąjį terno (Stern) sluoksnį (4 pav.). ie paviriuje asocijuoti krūviai sukelia stūmą tarp dalelių, neleisdami nanodalelėms susijungti.

terno sluoksnis Tirpiklio paalinimas

a) b)

4 pav. Nanodalelių stabilizavimas: a) krūvių stūma tarp dviejų krūvį turinčių dalelių ir b) erdvikai [11]

Erdviniui stabilizavimuiįtakos gali turėti prie dalelės paviriaus prisijungusi santykinai ilga tirpikliui gimininga molekulė. Dalelės nusėda tada, kada visas tirpiklis tarp ir aplink grandines pasialina. Tačiau toks virsmas energetikai nenaudingas ir nevyksta, todėl ir kuria erdvinį barjerą [11].

Nanodalelių paruoimas

Du pagrindiniai nanodalelių ruoimo metodai yra „top down“ ir „bottom up“. „Top down“ metodu nanodalelės ruoiamos i med˛iagų jas gerokai „apkarpant“, t.y. ma˛inant kol lieka tik nanodalelė. Da˛niausiai tai yra pasiekiama naudojant litografijos technologiją bei ofortą[1]. Komerciniais tikslais labiau naudojamas „bottom up“ metodas. Jis pagrįstas kitokiu principu – čia nanodalelės yra „auginamos“ i paprastų molekulių, o nanodalelių dydis yra ribojamas įvairiais būdais. Paprasčiausiai nanodalelių dydis valdomas kontroliuojant koncentraciją. Taip pat svarbios kitos priemonės – dalelės paviriaus funkcionalumas ar augimui naudojamos micelės ablonas.

„Bottom up“ metodu dalelių dydis kontroliuojamas laikantis superprisotinimo principo (5 pav.). Pirmose reakcijos stadijose galutinės med˛iagos koncentracija didėja drastikai, jokios nuosėdos nesusidaro. Jei reakcija vyksta pakankamai greitai, tuomet prisotinimo riba (grafike ˛ymima brūkniuota linija) gali būti pasiekta anksčiau nei med˛iaga pradės sėsti. Susidariusios pradinės dalelės tampa galinių dalelių „sėklomis“. Esant idealiai sistemai, daugiau jokių naujų produktų neatsiras, o pradinės dalelės augs. Tai yra pagrindinis „bottom up“ metodo veikimo principas [11].

NANO

5 pav. Nanodalelės formavimosi diagrama [11]

Polisacharidinių nanodalelių ruoimo metodai

Nanodalelėms i polisacharidų gauti naudojami įvairūs metodai: kovalentinis ar joninis tinklinimas, polimer-polimerinis polielektrolitų kompleksavimasis, hidrofobikai modifikuotų polisacharidų savaiminė agregacija. Gamtinių polisacharidų nanodalelių sintezei plačiausiai naudojamas chitozanas.

Kovalentikai susiūtos chitozano dalelės gali būti paruoiamos keliais skirtingais metodais: emulsinio susiuvimo, atvirktinės micelizacijos (reverse micellar), tirpiklio igarinimo, purkiamojo d˛iovinimo (spray-drying) arba terminio susiuvimo būdu. Kovalentiniam susiuvimui da˛niausiai naudojamas glutaro aldehidas. Deja, i med˛iaga yra toksika ląstelėms ir tai riboja taikymą vaistų pernaai [15]. Dar naudojami epoksidai, cianatai, karboksirūgtys [16].

Hidrofilinės chitozano nanodalelės gaunamos polisacharido grandinės aminogrupes kovalentikai susiuvant trumpagrandėmis gamtinėmis dikarboksi- (obuolių (hidroksibutano dirūgtis), gintaro (butano dirūgtis), vyno (2,3-dihidroksibutano rūgtis)) ir trikarboksi- (citrinų (2-hidroksi-1,2,3-propantrikarboksirūgtis)) rūgtimis. Karboksigrupių ir aminogrupių kondensacija vykdoma naudojant vandenyje tirpų agentą – karbodiimidą [15]. Karbodiimidai – tai sintetiniai organiniai junginiai, kurie aktyvuoja karboksigrupę, ir ji panaudojama amidinių ar esterinių ryių sudarymui. Da˛niausiai naudojami – dicikloheksanokarbodiimidas (DCC), N,N‘-diizopropilkarbodiimidas (DIC), 1-etil-3-[3-dimetilaminopropano] karbodiimidas (EDC) [8].

Ma˛amolekulių di- ir trikarboksirūgčių (maleino, citrinų, vyno) karboksigrupėms, aktyvuotoms karbodiimidais, sąveikaujant su laisvomis chitozano aminogrupėmis susidaro amidiniai ryiai ir formuojamos nanodaleles. iuo metodu gali būti paruoiamos rūgtiniuose, neutraliuose bei silpnai baziniuose vandeniniuose tirpaluose stabilios polikatijoninės, polianijoninės bei poliamfolitinės nanodalelės (6 pav.). Priklausomai nuo pH vertės, vidutinis dalelių dydis svyruoja 270 – 370 nm intervale [15].

6 pav. Kovalentikai susiūtų chitozano-karboksirūgčių nanodalelių struktūra [16]

Polikatijoninės nanodalelės gaunamos chitozanui sąveikaujant su dikarboksirūgtimis, kai susiuvimo laipsnis ma˛esnis nei 100 %. Karboksigrupės su chitozano aminogrupėmis sudaro kovalentinius ryius, o likusios laisvos aminogrupės parūgtintuose tirpaluose protonizuojasi ir gaunamos polikatijoninės nanodalelės. Neutralios nanodalelės gaunamos chitozanui reaguojant su dikarboksirūgtimis, esant stechiometriniam reagentų santykiui.

Nanodalelių sintezei naudojant trikarboksirūgties, pvz., citrinų, perteklių, kai susiuvimo laipsnis ma˛iau nei 100 %, formuojasi poliamfolitinės nanodalelės. Tai atsitinka dėl nesuregavusių karboksirūgties grupių, kurios neutraliuose bei arminiuose tirpaluose gali būti deprotonizuotos ir taip sukurti neigiamą krūvį, bei dėl likusių laisvų teigiamą krūvį turinčių chitozano aminogrupių. Esant karboksirūgties pertekliui, gaunamos polianijoninės nanodalelės, t.y., visos aminogrupės sudaro kovalentinius ryius, o likusios laisvos karboksigrupės sukuria neigiamą nanodalelių krūvį. Tačiau tokios nanodalelės nėra pakankamai stabilios, todėl ikrenta į nuosėdas [16].

Polikatijoninių (7 pav.) ar polianijoninių polisacharidų joniniam susiuvimui gali būti naudojami ma˛amolekuliai polianijonai ir polikatijonai. Plačiausiai paplitęs polianijonas – tripolifosfatas (TPF), kuris pirmą kartą panaudotas chitozano nanodalelių gamybai 1997 m. Jis yra netoksikas, pasi˛ymi dideliu anijoninių grupių kiekiu. Atsiradus joninei sąveikai tarp neigiamo TPF bei teigiamą krūvį turinčių chitozano aminogrupių, formuojamas gelis. TPF-chitozano nanodalelės plačiai pritaikomos vaistų ir makromolekulių pernaoje [15].

7 pav. Jonikai susiūtas chitozanas (- joninis ryys; + - teigiamą krūvį turintis chitozanas; - polianijonas) [18]

iuo metu nanodalelių ruoimui naudojami ir vandenyje tirpūs chitozano dariniai. ių junginių privalumas – lengvai itirpsta neutraliuose vandeniniuose tirpaluose. Taip apsisaugoma nuo ˛alingo rūgčių poveikio bei yra apsaugomas patalpintų biomolekulių biologinis aktyvumas.

8 pav. Chitozano-karboksimetilceliuliozės nanodalelių susidarymo schema [7]

Dėl tarpmolekulinių elektrostatinių sąveikų tarp polielektrolitinio polisacharido ir prieingą krūvį turinčio polimero gali formuotis polielektrolitinis kompleksas (PEK). Teorikai PEK nanodalelės gali susidaryti i bet kokių polielektrolitų, tačiau praktika rodo, kad tinkamiausi vandenyje tirpūs biosuderinami polimerai. Chitozanas – vienintelis polikatijoninis polisacharidas, tenkinantis ias sąlygas. Neigiamą krūvį turinčių polimerų, kurie su chitozanu formuoja nanodaleles, yra labai daug. Jie gali būti suskirstyti į polisacharidus, poliakrilo rūgties eimą ir kitus. Vienas tokių – karboksimetilceliuliozė, kuri su chitozanu savaime sudaro stabilias katijonines nanodaleles (8 pav.) [15].

Grį˛tamoji jungimosi–fragmentacijos grandinės perdavos polimerizacija

Grį˛tamoji jungimosi–fragmentacijos grandinės perdavos (RAFT) polimerizacija yra viena i gyvybingosios radikalinės polimerizacijos rūių. RAFT polimerizacijai būdingos bimolekulinės reakcijos, kur grandinės augimas pagrįstas kooperatine grandinės perdava tarp polimerinių grandinių, o ATRP ir NMP metu vyksta monomolekulinė radikalinė grį˛tamoji “sugavimo“ reakcija. Gausus monomerų pasirinkimas bei platus jų funkcionalumas leid˛ia kurti specifines bei sudėtingas architektūras. RAFT nuo paprastos radikalinės polimerizacijos skiriasi tuo, kad iuo atveju naudojamas grandinės perdavos agentas (GPA). GPA da˛niausiai turi tiokarboniltiogrupę ir reakcijos pabaigoje sudaro RAFT makroagentus. Sintetinamų polimerų vidutinės molekulinės masės apskaičiuojamos pagal formulę (1), todėl parinkus tinkamas reagentų (GPA, monomero, iniciatoriaus) koncentracijas, reakcijos sąlygas, galima gauti norimos molekulinės masės polimerą.

(1)

Sintetinamos vandenyje tirpios arba amfifilinės polimerinės struktūros, prie kurių gali būti jungiami įvairūs agentai. Gali būti sintetinami statistikiniai, gradientiniai, blokiniai, epečio struktūros, ˛vaig˛diniai, superakotieji ir tinkliniai kopolimerai (9 pav.) [19-21].

9 pav. RAFT polimerizacijos produktų pavyzd˛iai: a) gradientiniai kopolimerai, b) statistikiniai kopolimerai, c) ˛vaig˛diniai polimerai [19]

RAFT polimerizacija plačiai taikoma vaistų neikliams kurti. RAFT polimerizacijos pagalba galima gauti branduolio/apvalkalo formos nano- ir mikrodaleles bei kapsules. Redukavus tiokarboniltiogrupę, gaunama laisva tiolio grupė, kuri gali būti apsaugoma Ellmano reagentu ir toliau dalyvauti reakcijose su fluorescuojančiais peptidais ar DNR. RAFT polimerizacija gali būti vykdoma dispersinėse terpėse. iuo metodu sintetinami ir termogrį˛tamieji hidrogeliai. Vienas i tokių pavyzd˛ių – poli(NIPAAm )-blok-poli(N,N-dimetilakrilamido)-blok-poli(NIPAAm) triblokkopolimeras, kuris pasiekus poli(NIPAAm) virsmo temperatūrą, tampa grį˛tamuoju fizikiniu geliu. Gelio mechaninės savybės panaios į kolageną – biopolimerą, plačiai taikomą audinių in˛inerijoje [19].

METODINĖ DALIS

Naudotos med˛iagos ir tirpalai

Reagentai

Chitozanas, Sigma-Aldrich

Vidutinės molekulinės masės(400 000), DL 72 %

Heksano dirūgtis, (1,4-butandikarboksirūgtis, adipo rūgtis), Sigma-Aldrich

C₆H₁₀O₄, M_r 146,15, ρ 1,36 g/cm³, T_lyd 149-150 °C, T_vir. 337 °C, pK_a1 4,43, pK_a2 5,41

3-Karboksi-3-hidroksipentano dirūgtis, (2-hidroksi-1,2,3-propantrikarboksirūgtis, citrinų rūgtis)

C₆H₈O₇, M_r 210,14, ρ 1,665 g/cm³, T_lyd 153 °C, T_vir. 175 °C, pK_a13,15, pK_a24,77, pK_a36,40

2,3-Dihidroksibutano dirūgtis (vyno rūgtis)

C₄H₆O₆, M_r 150,09, ρ 1,79 g/cm³, T_lyd 171–174 °C (L-vyno), T_lyd 206 °C (DL, racematas), T_lyd 146–148 °C (mezo)

(4-Cianpentano rūgties)-4-ditiobenzenkarboksilatas (CPAD)

C₁₃H₁₃ N O₂₂S₂, M_r 256

4-Ciano-4[(dodecilsulfaniltiokarbonil)sulfanil]pentano rūgtis (TTR)

C₁₉H₃₃N₂O₂S₃, M_r 403,67, T_lyd 64-68 °C

1-Etil-3-[3-dimetilaminopropano]karbodiimido hidrochloridas (EDC), Merck

C₈H₁₈N₃Cl, M_r 191,70, ρ 0,88 g/cm³, T_vir. 47–48 °C

4,4-Azodiizo(4-cianpentankarboksirūgtis) (ACPR)

C₁₂H₁₆N₄O₄, M_r 280,30, T_lyd 118-125 °C

2-Hidroksietilmetakrilatas (HEMA)

C₆H₁₀O₃, M_r 130,14, ρ 1,073 g/cm³

Natrio chloridas

NaCl, M_r 58,44, ρ 2,17 g/cm³, T_lyd 801 °C, T_vir. 1413 °C, n_D 1,54

Natrio hidroksidas (natrio armas)

NaOH, M_r 40, ρ 2,13 g/cm³, T_lyd 318 °C, n_D 1,412

Kalio hidroksidas (kalio armas)

KOH, M_r 56,11, ρ 2,04 g/cm³, T_lyd 420 °C, T_vir. 1327 °C, n_D 1,41

Acto rūgtis

C₂H₃O₂H, M_r 60,05, ρ_s 1,049 g/cm3, T_lyd 16,5 °C, T_vir. 118,1 °C, pK_a 4,76

1,4-Dioksanas

C₄H₈O₂, M_r 88,11, ρ 1,03 g/cm³, T_lyd 11,8 °C, T_vir. 101,1 °C

Druskos rūgtis (vandenilio chloridas)

HCl, M_r 36,46, ρ 1,18 g/cm³, n_D 1,342, T_vir. 110 °C (20,2 % tirpalas), T_vir. 48 °C (38 % tirpalas), T_lyd -26 °C (38 % tirpalas)

Metanolis

CH₄O, M_r 32,04, ρ 0,79 g/cm³, T_lyd −97 °C, T_vir. 64,7 °C,

Buferiai

0,5 M CH₃COOH/ 0,5 M CH₃COONa

0,2 M CH₃COOH/ 0,15 M CH₃COONH₄

Sintezės metodikos

Chitozano N-modifikavimas adipo rūgtimi

0,0127 g (0,0867 mmol) adipo rūgties itirpinama 10 ml vandens ir 0,1 M NaOH tirpalu paarminama iki pH 6,5. Atald˛ius ledo vonioje, įdedama 0,0499 g (0,26 mmol) EDC ir 30 min. stipriai maioma magnetine maiykle (850 aps/min). Į gautą miinį sulainamas 0,15 % chitozano tirpalas, gautas 0,1508 g (0,867 mmol) liofilizuoto chitozano (DL = 72%) itirpinus 100 ml 2 % acto rūgties ir 0,1 M NaOH tirpalu paarminus iki pH 6,5. Reakcija vykdoma 24 val. kambario temperatūroje maiant magnetine maiykle. Reakcijai pasibaigus, reakcijos miinys 72 val. dializuojamas vandenyje naudojant Visking (SERVA, MWCO 12 000-14 000) dializės ˛arną ir liofilizuojamas. Ieiga 0,1102 g (71,35 %, kai PL 13 %).

Chitozano modifikavimas vyno ar citrinų rūgtimis vykdomas pagal tą pačią metodiką.

Adipo rūgtimi modifikuoto chitozano N-modifikavimas TTR

0,04 g (0,1 mmol) 4-cian-4[(dodecilsulfaniltiokarbonil)sulfanil]pentano rūgties (TTR) itirpinama 10 ml 1,4-dioksano ir 0,1 M NaOH tirpalu paarminama iki pH 6,5. Tirpalą atald˛ius ledo vonioje, į jį įdedama 0,1 g (0,5 mmol) EDC. Į gautą miinį lėtai sulainama 0,1 g (0,5 mmol) adipo rūgtimi modifikuoto chitozano (PL 13 %), itirpinto 10 ml 2,0 % acto rūgties, prie tai 0,1 M NaOH tirpalu padidinus jo pH iki 6,5. Reakcija vykdoma 24 val. kambario temperatūroje maiant magnetine maiykle. Po to tirpalas 72 val. dializuojamas vandenyje naudojant Visking (SERVA, MWCO 3500) dializės ˛arną. Produktas liofilizuojamas 40 sC temperatūroje. Ieiga 0,0698 g (kai PL 13 %).

N-modifikavimas kitu RAFT perdavos agentu – CPAD – vykdomas pagal tą pačią metodiką.

HEMA polimerizacija RAFT būdu

0,05 g (0,231 mmol) adipo rūgtimi ir TTR modifikuoto chitozano itirpinama 2 ml 2 % acto rūgties. Įdedama 0,8678 mg (0,0031 mmol) iniciatoriaus (ACPR) bei 0,04 ml (0,3096 mmol) 2-hidroksietilmetakrilato (HEMA). Polimerizacijos miinys prapučiamas 40 min. N₂ dujomis. Polimerizacijos reakcija vykdoma 6-8 val. 60 sC temperatūroje, maiant magnetine maiykle. Pasibaigus reakcijai, miinys 72 val. dializuojamas vandenyje naudojant Visking (SERVA, MWCO 3500) dializės ˛arną. Produktas liofilizuojamas 40 sC temperatūroje. Ieiga 0,0410 g .

Polimerizacijos reakcija naudojant kitą RAFT makroagentą – adipo rūgtimi ir CPAD modifikuotą chitozaną – vykdoma pagal tą pačią metodiką.

Analizės metodikos

Karboksigrupių kiekio nustatymas

Analizinėmis svarstyklėmis pasveriama 0,05 g tiriamo polimero ir itirpinama 20 ml metanolio. Kadangi med˛iaga blogai tirpsta, kolba sujungiama su grį˛tamuoju auintuvu ir 1 val. kaitinama. Po to, tirpalas atvėsinamas ir titruojamas 0,1 M metanoliniu KOH tirpalu, indikatoriumi naudojant alkoholinį fenolftaleino tirpalą. Tirpiklio neutralumui patikslinti daromas kontrolinis bandymas. Karboksigrupių kiekis apskaičiuojamas i ne ma˛iau kaip dviejų lygiagrečiai darytų analizių.

Karboksigrupių kiekis X_COOH(%) tiriamojoje med˛iagoje apskaičiuojamas pagal formulę:

(2)

čia: V₁ ir V₂– KOH tirpalo, sunaudoto tiriamajai med˛iagai ir kontroliniam bandiniui titruoti, tūris, ml;

C – KOH tirpalo koncentracija, mol/g;

– COOH grupės santykinė molekulinė masė;

g – bandinio masė, g.

Aminogrupių kiekio nustatymas

0,1 g tiriamos med˛iagos itirpinama 20 ml 0,1 M HCl ir titruojama 0,1 M NaOH. Indikatoriumi naudojamas metileno mėlynojo ir metileno raudonojo miinys. Daromi du kontroliniai bandiniai.

Pirminių aminogrupių kiekis X_NH2 (%) apskaičiuojamas pagal formulę:

(3)

čia: V₁ ir V₂– NaOH tirpalo, sunaudoto tiriamajam ir kontroliniam tirpalui titruoti, tūris, ml;

c – KOH tirpalo koncentracija, mol/g;

16 – NH₂ grupės santykinė molekulinė masė;

g – bandinio masė, g.

Chitozano pakeitimo laipsnio jo kopolimeruose skaičiavimas

Pakeitimo laipsnis (PL, %) parodo, kiek vidutinikai grandinių yra prijungta prie 100 chitozano grand˛ių.

Chitozano N-darinių pakeitimo laipsnis (PL) apskaičiuojamas i ¹H-BMR spektrų, lyginant priskiepytai grandinei būdingų protonų ir chitozano acetilgrupės ties 1,8-1,9 ppm arba H-2 protono ties 2,97 ppm signalų intensyvumus pagal formules:

(4)

(5)

čia: H – analitinio protonų signalo priskiepytoje grandinėje smailės plotas;

n – analitinio signalo protonų, esančių priskiepytoje grandinėje, skaičius;

A – acetatinės grupės signalo plotas;

B – H-2 protono signalo plotas.

Spektroskopinis chitozano darinių tyrimas

Tiriamos med˛iagos FT-IR spektrai u˛rayti i KBr tablečių PERKIN ELMER 1000 Spectrum BX spektrometru sausame ore 20 sC temperatūroje. Skenavimo parametrai: ribos 520–3600 cm^-1, 16 skanų, skiriamoji geba 2 cm^-1. H-BMR spektrai u˛rayti UNITY INOVA Varian 00 MHz spektrometru 5 mm BMR ampulėse 29 °C temperatūroje. Tirpalai buvo ruoiami D₂O arba D₂O, turinčiame 1 laą DCl arba acto rūgties-d₄.

Chitozano darinių savybių tyrimas

Ribinio klampos skaičiaus nustatymas

Paruoiami 0,15 g/dl koncentracijos polimerų tirpalai acetatiniame buferyje (0,5 M CH₃COOH/ 0,5 M CH₃COONa). Tirpalų klampa buvo matuojama Ubelodės viskozimetru 25 sC temperatūroje. Praskiedimams naudojama tiek acetatinio buferio, kad susidarančiame tirpale pradinio polimero tirpalo būtų ²/₃, ¹/₂, ¹/₃ ir ¹/₄. Ribinis klampos skaičius ([η]) nustatomas klampos skaičių (η_red) ir logaritminį klampos skaičių (η_lns) ekstrapoliuojant į nulinę koncentraciją.

Potenciometrinis titravimas

0,025 g med˛iagos itirpinama 5 ml 0,01 M HCl/0,1 M NaCl ir potenciometrikai titruojama 0,05 M NaOH/0,1 M NaCl tirpalu, kiekvieną kartą sulainant po 0,05 ml 0,05 M NaOH/0,1 M NaCl. Įpylus armo, tirpalas apie 1 min. maiomas ir tik tuomet u˛raomi pH-metro CyberScan pH6000 rodmenys. Titruojama tol, kol pH vertė pasiekia 11-12. Nubrė˛us potenciometrinio titravimo kreivę, grafiniu būdu nustatomas visiko neutralizavimo (ekvivalentinis) takas. Nustačius ekvivalentinį taką, apskaičiuojamas polielektrolito jonizacijos laipsnis α kiekvienam potenciometrinės kreivės takui. Susitarta, kad visiko neutralizavimo take jonizacijos laipsnis α=1, o pradiniame tirpale (prie neutralizaciją) – α=0. Pasinaudojant polielektrolito titravimo kreive, surandamos pH vertės, atitinkančios jonizacijos laipsnį 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8 ir 0,9. I gautų duomenų brė˛iama priklausomybė Henderson‘o ir Hazelbalch‘o lygties koordinatėse, t.y. tirpalo pH priklausomybė nuo lg[α/(1-α)].

Poliamfolito izoelektrinio tako nustatymas

Atliekant tiriamų junginių 0,03 M HCl ar 0,03M HCl/0,1 M NaCl tirpaluose potenciometrinį titravimą 0,03 M NaOH ar 0,03 M NaOH/0,1 N NaCl, pasiekus pH vertes 4, 4,25, 4,5, 4,75, 5, 6, 7, 8, 9, supaprastintos konstrukcijos 0,54 mm diametro kapiliaro viskozimetru matuojama tirpalo santykinė klampa. Kiekviename take tirpalo itekėjimo laikas matuojamas ne ma˛iau kaip 3 kartus ir apskaičiuojama vidutinė τ vertė. Prie kiekvieną naują matavimą viskozimetras praplaunamas matuojamu skysčiu – į talpyklą kelis kartus įsiurbiamas tirpalas leid˛iant jam itekėti.

Nubrė˛us tirpalo savitosios klampos priklausomybę nuo pH, nustatomas med˛iagos izoelektrinis takas – pH vertė, kuriai esant tirpalo savitoji klampa yra ma˛iausia.

Molekulinių sietų chromatografija

Molekulinių sietų chromatografija yra santykinis polimerų molekulinės masės nustatymo metodas. io proceso metu makromolekulės yra frakcionuojamos pagal jų hidrodinaminį tūrį. Itirpusio polimero tirpalas, turintis platų molekulinių masių pasiskirstymą, yra paleid˛iamas pro chromotografines kolonėles.

Polimerų molekulinė masė nustatoma naudojant molekulinių sietų chromatografijosįrangą, kurią sudarė trys detektoriai – viesos sklaidos detektorius PL-ELS-1000, UV detektorius UVD-250 ir lū˛io rodiklio (IR) detektorius Viskotek TDA Model 301, automatinio bandinių paėmimo įrenginys Midas (Spark Instruments, The Netherlands), siurblys (Watrex Comp.) ir dvi kolonėlės PL Aquagel-OH MIXED (8 μm), tinkančios tirti med˛iagas, kurių molekulinė masė 100 – 1 10⁶ g/mol, vandeniniuose tirpaluose.

Paruoiami 1 % polimerų tirpalai acetatiniame buferyje (0,15 M CH₃COONH₄/ 0,2 M CH₃COOH; pH = 4,2). Bandiniai filtruojami pro 0,45 μm filtrą, supilami į indelius ir talpinami į Midą. Duomenys kaupiami ir apdorojami naudojant Astra ir tri-SEC programines įrangas.

Dinaminė viesos sklaida

viesos sklaidos metodas paremtas ma˛ų dalelių, esančių tirpaluose, Brauno judėjimo tyrimu. iuo metodu matuojamas atsispindėjusios nuo polimero tirpale esančių makromolekulių viesos srauto intensyvumas.

Dalelių hidrodinaminis spindulys nustatomas dinaminės viesos sklaidos pagalba. Paruoiami 1 % bandiniai acetatiniame buferyje, filtruojami pro 0,45 μm porų dyd˛io filtrus. Kalibravimui naudojamas toluenas, kuris pasi˛ymi didele viesos sklaida. Tyrimas atliekamas 25 °C temperatūroje. Pirmiausiai matuojama tirpiklio, o tik paskui tiriamo tirpalo viesos sklaida. Kiuvetė su tiriamu mėginiu įstatoma į specialią celę taip, kad lazerio viesa gerai praeitų. Eksperimento metu naudojamo 30 mW He-Ne lazerio bangos ilgis – 632 nm, o lazerio viesos sklidimo kampas – 90°. Matuojamos intensyvumų fliuktuacijos/svyravimai, kurie perskaičiuojami į intensyvumų koreliacijų funkcijas –isklaidytos viesos intensyvumo priklausomybes nuo laiko. Duomenys kaupiami ir apdorojami naudojant ALV programinę įrangą. Gaunama koreliacijos funkcija, reikalinga difuzijos koeficientui surasti (D). Tiriamų dalelių hidrodinaminis spindulys (R_h) apskaičiuojamas pagal lygtį:

(6)

čia: k – Bolcmano konstanta, erg/K;

T – absoliučioji temperatūra, K;

η – tirpiklio klampa.

REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

io darbo metu buvo susintetintos ir itirtos chitozano nanodalelės bei jų dariniai. Nanodalelės gautos vidutinės molekulinės masės chitozaną (DL=72 %) per aminogrupę veikiant ma˛amolekulėmis di- ir trikarboksirūgtimis. Prie chitozano nanodalelių prijungiant RAFT grandinės perdavos agentus CPAD bei TTR, buvo bandoma susintetinti polisacharidinį RAFT makroiniciatorių, nuo kurio paviriaus vykdant hidroksietilmetakrilato (HEMA) RAFT polimerizaciją, būtų galima gauti nanodaleles biotechnologijos ar biomedicinos reikmėms.

Gautieji chitozano dariniai buvo identifikuoti i jų FT-IR, ¹H-BMR spektrų, imatuota jų tirpalų klampa, molekulinių sietų chromatografijos (MSC) metodu nustatyta molekulinė masė, dinaminės viesos sklaidos metodu (DLS) nustatyti dalelių dyd˛iai, potenciometrikai nustatytos susintetintų nanodalelių pK_a vertės bei aminogrupių kiekis. Chitozano pakeitimo laipsnis (PL, %) buvo apskaičiuojamas i ¹H-BMR spektrų.

Chitozano nanodalelių sintezės rezultatai

Chitozano dalelės pasi˛ymi bioadhezinėmis savybėmis. Be to, jos naudojamos vaistų neikliams kurti. Teigiamai įkrautas chitozanas gali sąveikauti su neigiamai įkrautomis molekulėmis (DNR, RNR) jas stabilizuodamas ar apsaugodamas nuo skilimo.

Chitozano nanodalelės buvo susintetintos karbodiimidiniu metodu, kovalentikai susiūnant chitozaną ma˛amolekulėmis di- ir trikarboksirūgtimis. Chitozanas yra gamtinis polimeras, o i jo padarytos nanodalelės gali būti taikomos medicinoje. Sintezei vykdyti pasirinktos natūralios karboksirūgtys: adipo (AR), vyno (VR) ir citrinų (CR) (10 pav.).

800px-Adipic_acid_svg 625px-Tartaric_acid_svg 256PX-~1

a) b) c)

10 pav. Chitozano modifikavimui naudotos karboksirūgtys: a) adipo, b) vyno, c) citrinų

Karboksirūgtys prie chitozano aminogrupių buvo jungiamos karbodiimidiniu metodu, naudojant vandenyje tirpų karbodiimidą N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilkarbodiimido hidrochloridą (EDC) (11 pav.).

11 pav. Chitozano modifikavimas dikarboksirūgtimis

EDC arba EDAC – tai 1-etil-3-[3-dimetilaminopropano]karbodiimido hidrochloridas. Jis tirpus ne tik vandenyje, bet ir metileno chloride, N,N-dimetilformamide (DMF), tetrahidrofurane (THF). EDC komercikai da˛niausiai parduodamas HCl ar jodmetano druskų pavidalu. Agentas naudojamas amidų, esterių ar tioesterių ryių sudarymui, formuojant heterociklinius ˛iedus. Be to, gali būti naudojamas skersiniams ryiams baltymuose, nukleorūgtyse sudaryti, vandeniniuose ar organiniuose tirpaluose įvairioms molekulėms prie paviriaus prijungti. Jis neatsparus stiprių oksidatorių ar stiprių rūgčių poveikiui. EDC aktyvus 4,0 - 6,0 pH intervale [17, 22-23].

Vandenyje tirpi karbodiimido HCl druska pasi˛ymi ilgalaikiu stabilumu. Ji nehidroskopika, nors iek tiek jautri hidrolizei. Būdinga ˛iedinė tautomerija (12 pav.). Karbodiimido tirpalo chloroforme IR sugerties spektre matyti sugertiems juosta ties 2130 cm^-1, kuri būdinga atviroje grandinės formoje esančiai –N=C=N- grupei. Tuo tarpu kietos druskos FT-IR spektrai rodo sugerties juostas ties 3250 ir 1700 cm^-1, kurios priskiriamos N-H bei C=N ryių virpesiams. ie ryiai būdingi kristalinės formos EDC cikliniams tautomerams [22].

EDC-goood

12 pav. EDC struktūrinė formulė ir jo tautomerija [22]

Kondensacijos reakcijos metu EDC reaguoja su pirmos molekulės karboksigrupe, susidarant tarpiniam O-acilizourėjos produktui, kuris toliau reaguoja su aminais (13 pav.).

karbodimidinis___rysys

13 pav. EDC veikimo mechanizmas [22]

O-acilizourėjai reaguojant su antros molekulės aminogrupe, susiformuoja stiprus amidinis ryys. Be to, tarpinis produktas gali lengvai hidrolizuotis. Hidrolizės metu jis tampa nestabiliu ir suyra, susidarant pradinei karboksigrupei. Tarpinį O-acilizourėjos junginį stabilizuoja N-hidroksisulfongintaro rūgties imido (sulfo-NHS) pridėjimas. Pridėjus sulfo-NHS, susidaro sulfo-NHS esteris, kuris yra pakankamai stabilus ir gali dalyvauti dviejų stadijų susiuvimo reakcijose [22].

Chitozano modifikavimas adipo, vyno ir citrinų rūgtimis buvo vykdomas vandeninėje terpėje (pH 6,5), reakciją vykdant kambario temperatūroje 24 val. Pasibaigus reakcijai, reakcijos miinys 72 val. dializuojamas vandenyje, naudojant Visking (SERVA, MWCO 12 000-14 000) dializės ˛arną. Jos metu, esant skirtingoms koncentracijoms membranoje bei cilindre, dėl difuzijos ma˛amolekuliai junginiai difunduoja į ma˛esnės koncentracijos aplinką. Tokiu būdu produktas gryninamas nuo nesuregavusių ma˛amolekulių karboksirūgčių bei karbodiimido liekanų. Siekiant pagerinti tirpumą ir norint ivengti didesnio susisiuvimo, produktas d˛iovinamas liofilizuojant. Gaunama puri, akyta med˛iaga, puikiai tinkanti tolesnėms sintezėms.

Nanodalelės buvo susintetintos naudojant įvairius chitozano ir karboksirūgčių santykius. Norint ivengti didelio dalelių susiuvimo laipsnio, kuris junginį gali paversti į netirpų, tankiai susiūtą gelį, bei planuojant nanodaleles toliau dar modifikuoti per likusias laisvas chitozano aminogrupes, sintezei buvo naudojami ma˛esni karboksirūgčių moliniai kiekiai (reakcijos terpėje sukuriant aminogrupių perteklių). Buvo naudotas perteklinis EDC kiekis, kadangi ˛inoma, kad jo reikia dvigubai ar trigubai daugiau negu yra karboksigrupių. Prikausomai nuo rūgties, aminogrupių kiekis karboksigrupių at˛vilgiu sudarė nuo 15 iki 70 %. Sintezės rezultatai parodė, kad didinant santykinį karboksirūgčių kiekį, chitozano pakeitimo laipsnis didėja. Karboksirūgtimis N-modifikuotų chitozano darinių ieiga siekė 63-88 %. Did˛iausias chitozano pakeitimo laipsnis (PL) buvo pasiektas naudojant CHZ-CR3 (PL 26 %) (1 lentelė).

1 lentelė. Chitozano modifikavimo karboksirūgtimis rezultatai

Nr.

Karboksirūgtis

Junginys

Mol. sant.

Chz:rūgtis

(-NH₂):(-COOH) sant.

PL %

[η], dL/g

Adipo r.

CHZ-AR

CHZ-AR2

CHZ-AR3

3,24

Vyno r.

CHZ-VR

Citrinų r.

CHZ-CR1

CHZ-CR2

CHZ-CR3

* - chitozano PL apskaičiuotas i azoto kiekio

Susintetinti chitozano N-modifikuoti dariniai buvo identifikuoti FT-IR ir ¹H-BMR spektroskopiniais metodais. Adipo rūgtimi modifikuoto chitozano ¹H-BMR spektre D₂O/acto rūgtyje-d⁴ matyti chitozanui ir karboksirūgčiai būdingi signalai.

14 pav. Chitozano (1) ir CHZ-AR (PL 10 %) (2) (D₂O/acto rūgtis-d₄) ¹H BMR spektrai

Kaip matyti 14 pav., N-modifikuotame darinyje atsiranda nauji, chitozanui nebūdingi signalai ties 1,44 ir 2,25 p.pm. Cheminis poslinkis ties 1,44 p.pm. priskiriamas adipo rūgties alifatinės grandinės metileno grupių –(CH₂)₂- protonams. Tuo tarpu signalas ties 2,25 p.pm. priskiriamas adipo rūgties metilgrupių, esančių prie karboksigrupių, protonams. Lyginant chitozano protono ties antruoju anglies atomu (2,97 p.pm.) signalo intensyvumą su minėtų protonų, esančių modifikuojančios rūgties liekanoje, signalų intensyvumu, buvo apskaičiuotas chitozano pakeitimo laipsnis. Chitozano pakeitimo laipsnis jo dariniuose kinta nuo 7 iki 26 % (1 lentelė). Esant ma˛am chitozano pakeitimo di- ir trikarboksirūgtimis laipsniui (PL 7-22 %), gauti vandeninėje terpėje tirpūs kopolimerai, tačiau kai PL 26 % ir daugiau, gauti dariniai vandeninėje terpėje netirpsta.

Buvo nustatytas tirpių chitozano darinių ribinis klampos skaičius. Chitozano modifikavimo di- ir trikarboksirūgtimis produktų ribinis klampos skaičius [η] ma˛esnis negu pradinio chitozano ir priklausomai nuo PL kinta nuo 2,44 iki 4,26 dL/g (1 lentelė). Ribinio klampos skaičiaus vertės suma˛ėjimas chitozaną dalinai tinklinant yra laukiamas, kadangi susidarančių akotų makromolekulių tankis yra didesnis, o jų hidrodinaminis spindulys ma˛esnis.

Apie sėkmingą chitozano N-modifikavimo karboksirūgtimi reakciją galima spręsti ir i FT-IR spektrų. Lyginant chitozano ir adipo rūgtimi modifikuoto chitozano (PL 10 %) FT-IR spektrus matyti, kad modifikuoto darinio spektre padidėja sugerties juosta ties 1407 cm^-1, priskiriama adipo rūgties alifatinei grandinei (15 pav.).

15 pav. Chitozano (1) ir CHZ-AR (PL 10 %) (2) FT-IR spektrai

Buvo itirtos susintetintų chitozano darinių molekulinės masės molekulinių sietų chromatografija (MSC). Tyrimo metu naudota triguba detekcija, kurią sudarė viesos sklaidos, lū˛io rodiklio bei klampos detektoriai.

Junginių MSC rezultatai pateikti 2 lentelėje. Kaip matyti, N-modifikuotų chitozano darinių masinė molekulinė masė ma˛esnė negu pradinio chitozano. Galimos to prie˛astys – dalinis med˛iagų praradimas filtravimo metu, arba dalinė polimero adsorbcija kolonėlėje. Visų bandinių eliuavimo kreivės RI jutiklio at˛vilgiu buvo bimodalinės, o viesos sklaidos jutiklio at˛vilgiu – unimodalinės ir pasislinkusios ma˛esnio eliuavimo tūrio kryptimi (16 pav.). Didelės molekulinės masės (ma˛esnio eliuavimo tūrio) frakcija priskirtina dalinai tinklinto chitozano makromolekulėms. Ma˛amolekulės frakcijos, fiksuojamos tik lū˛io rodiklio jutikliu, signalo kilmė neaiki.

5 pav. CHZ-AR3 (PL 19 %) MSC eliucijos kreivės. Detektuota su viesos sklaidos (LS) ir lū˛io rodiklio (RI) jutikliais

Viena i svarbiausių nanodalelių charakteristikų yra jų dyd˛io įvertinimas. Taigi, susintetintos nanodalelės buvo itirtos dinaminės viesos sklaidos (DLS) metodu.

Ityrus daleles DLS metodu nustatyta, kad joms būdingas bimodalinis pasiskirstymas (17 pav.). Nanodalelių hidrodinaminis spindulys priklauso nuo sintezei naudotos di(tri)karboksirūgties ir siekia 230-850 nm (3 lentelė). alia nanodalelių yra ir chitozano (ar modifikuoto chitozano) makromolekulių, kurių hidrodinaminis spindulys 10-55 nm.

2 lentelė. MSC metodu nustatytos molekulinės masės

Junginys	PL, %	M_n	M_w	M_w/M_n	η]*, dL/g
CHZ
CHZ-AD					2,12
CHZ-AD					2,42
CHZ-VR
CHZ-VR
CHZ-CR					1,71
CHZ-CR					1,69

17 pav. CHZ-AR (PL 19%) koreliacijos funkcija (kairėje) ir makromolekulių ir nanodalelių hidrodinaminių spindulių pasiskirstymo kreivės (deinėje)

Chitozanas yra gamtinis katijoninis polimeras, turintis laisvų aminogrupių, kurios gali protonizuotis. Sintetinant nanodaleles, prie chitozano gali prisijungti ne visos reaktingos karboksigrupės, t.y., dalis karboksigrupių gali likti laisvų, galinčių jonizuotis. Dėl ios prie˛asties buvo tiriama, ar chitozano modifikavimo di- ir trikarboksirūgtimis produktai pasi˛ymi poliamfolitams būdingomis savybėmis. Vienas i būdų tai padaryti – potenciometrinis titravimas, kurio metu galima nustatyti poliamfolitų rūgtines ir bazines savybes.

Potenciometrikai titruojant chitozano darinių vandeninius tirpalus, esant pastoviai joninei jėgai (0,1 M NaCl), buvo gautos du perlinkius turinčios titravimo kreivės (18 pav.). Pirmajame perlinkio take (pH apie 4-6) pilnai neutralizuojamas HCl ir karboksigrupės, o antrajame (pH apie 8-10) – protonizuojamos aminogrupės.

3 lentelė. Hidrodinaminiai nanodalelių spinduliai, nm

Nr.	Junginys	Intensyvumas	R_h, nm
				11	CHZ-AD (PL 10 %)	0,062 0,855	10,5 849

2	CHZ-AD (PL %)	0,230 0,768	10,6 395

33	CHZ-VR (PL 24 %)	0,021 0,923	55 633
3
44	CHZ-VR (PL %)	0,020 0,785	24,9 564

55	CHZ-CR (PL 7 %)	0,155 0,830	10,2 232

66	CHZ-CR (PL 17 %)	0,118 0,491	16,1 323

18 pav. CHZ-CR (PL 17%) (1), CHZ-VR (PL 22%) (2) ir CHZ-AR (PL 15%) (3) potenciometrinio titravimo kreivės

I chitozano darinių titravimo kreivių (18 pav.) buvo rasti ekvivalentiniai takai bei apskaičiuoti polielektrolitų jonizacijos laipsniai kiekvienam potenciometrinės kreivės takui. Potenciometrinio titravimo duomenis pateikus Hendersono-Hazelbalcho lygties koordinatėse (19 pav.), buvo įvertintos chitozano pK_α vertės iuose dariniuose (4 lentelė). Chitozano pK_a vertė 6,3 [2], o rastos pK_a vertės jo dariniuose yra nuo 6,64 iki 7,65. Did˛iausia pK_a vertė (7,65) yra chitozano darinyje CHZ-CR (PL 17%), kuriame aminogrupių kiekis ma˛iausias (2,22 %), o ma˛iausia pK_a vertė ( chitozano darinyje CHZ-AR (PL 15%), kuriame aminogrupių kiekis did˛iausias (6,16 %). Vadinasi, lyginant su pradiniu chitozanu, chitozano darinių pK_a verčių didėjimas bei laisvų aminogrupių kiekio ma˛ėjimas leid˛ia daryti ivadą, kad sėkmingai įvyko reakcija.

19 pav. CHZ-N-AD (1:0,23) potenciometrinio titravimo duomenys, pateikti Hendersono – Hazelbalcho lygties koordinatėse

4 lentelė. Potenciometrinio titravimo rezultatai

Nr.	Chitozano darinys	-NH₂, %	pKa	COOH
	CHZ-AR (PL 15%)
	CHZ-VR (PL 8%)
	CHZ-VR (PL 22%)
	CHZ-CR (PL 17%)

CCOOH* - karboksigrupių kiekis nustatytas i cheminės analizės duomenų

Norint įsitikinti, kad karboksirūgtimis modifikuoti chitozano dariniai pasi˛ymi polielektrolitams būdingomis savybėmis, buvo mėginta nustatyti izoelektrinį taką. Kaip matyti i 20 pav., didinant pH, savitoji klampa pastoviai ma˛ėjo. Pastebėta, kad esant pH 7 tirpalas darėsi balzganas, t.y. prasidėjo makromolekulių aglomeracija ir dalelių agregacija. Taigi, dėl blogo chitozano darinio tirpumo arminėje terpėje izoelektrinio tako nustatyti negalėjome. Tačiau yra ˛inoma [24], kad amfoterinį polimerą potenciometrikai titruojant vandenyje ir druskos tirpale, titravimo kreivės kertasi take, kuris labai artimas izoelektriniam takui. Titruojant chitozano-N-AR (PL 10 %) darinį, titravimo kreivės kertasi ties pH 6,5. Remiantis ia teorija galima teigti, kad gautos dalelės pasi˛ymi poliamfolitams būdingomis savybėmis.

20 pav. CHZ-AR (PL 10 %) savitosios klampos priklausomybė nuo pH 0,03 M HCl (2) ir 0,03 M HCl/0,1 M NaCl tirpale (1)

Nanodalelių panaudojimas RAFT polimerizacijoje

Susintetintos nanodalelės buvo naudojamos RAFT makroiniciatorių sintezei. Prie jų prijungti du skirtingi grandinės perdavos agentai (GPA) (4-cianpentano rūgties)-4-ditiobenzenkarboksilatas (CPAD) ir 4-ciano-4[(dodecilsulfaniltiokarbonil)sulfanil]pentano rūgtis (TTR), taip gaunant makroiniciatorius. Po to, vykdant RAFT polimerizaciją ir naudojant iniciatorių ACPR, chitozano nanodalelės buvo “aprengtos” polihidroksietilmetakrilato (pHEMA) sluoksniu.

Vienas i svarbiausių etapų vykdant RAFT polimerizaciją - tinkamas GPA pasirinkimas. RAFT agentas turi tiokabonilgrupę (S=C-S) bei du skirtingus pakaitus R ir Z, kurie lemia polimerizacijos kinetiką bei kontroliuoja struktūrą (21 pav.).

RAFT-STRUCTURE

21 pav. GPA struktūra [24]

Priklausomai nuo esančių R ir Z pakaitų kinta RAFT agento tirpumas bei reaktingumas. Agentus sudaro trys pagrindinės klasės: ditiobenzoatai, tritiokarbonatai, ditiokarbamidai.

Vienas i mūsų pasirinktų GPA buvo CPAD (22 pav.). Jis naudojamas vykdant daugelio monomerų (stireno, akrilatų, metakrilatų) RAFT polimerizaciją. HEMA taip pat yra metakrilatas.

22 pav. Grandinės perdavos agentas CPAD (kairėje) ir iniciatorius ACPR (deinėje)

CPAD puikiai kontroliuoja polimero molekulinę masę, ilaiko ma˛ą polidispersikumą. is agentas taikomas įvairiose reakcijos terpėse – tirpaluose, suspensijose, emulsijose. CPAD gali būti gryninamas perkristalinant. Svarbiausias CPAD privalumas – jį galima naudoti vandeniniuose tirpaluose, kuriuose taip pat tirpios ir mūsų susintetintos nanodalelės. is GPA savo Z pakaite turi fenilgrupę, o R – 4-cianpentano rūgtį. Kai R grupė yra paalinama, susidaręs radikalas yra identikas iniciatoriaus 4,4’-azo-bis-(4-cianopentano rūgties) (ACPR) radikalui (22 pav.).

Apie sėkmingą CPAD prijungimą prie nanodalelių galime spręsti i ¹H BMR spektrų. CHZ-N-AR-N-CPAD ¹H BMR spektre be chitozano ir adipo rūgties signalų atsiranda ir labai silpni CPAD protonams būdingi signalai 1,8-2,5 m.d. srityje (23 pav.). Rūgtinėje terpėje CHZ-N-AR-N-CPAD dariniai įgauna tokią konformaciją, kad hidrofobinės CPAD liekanos „paslepiamos“ makromolekulių viduje, todėl CPAD arilgrupės protonų signalas arba nematomas, arba labai silpnas. Spektre gerai matomas CPAD metilgrupės protonų signalas ties 1,92 m. d., todėl lyginant io signalo ir chitozano H-2 protono (2,97 m. d.) signalo intensyvumus buvo apskaičiuotas chitozano PL jo dariniuose su CPAD.

23 pav. CHZ-N-AR (PL 10 (D₂O/acto rūgtis-d₄), CPAD (CDCl₃) (2) ir CHZ-N-AR (PL 10%)-N-CPAD (PL 12% (D₂O/acto rūgtis-d₄) (3) ¹H BMR spektrai

Susintetintas RAFT makroiniciatosius CHZ-AR (PL 10%)-CPAD (PL 12%) buvo itirtas MSC ir DLS metodais (24 pav.). Nustatyta jo vidutinė masinė molekulinė masė M_w = 111 400 yra ma˛esnė u˛ pradinės nanodalelės (5 lentelė). Tai galima būtų paaikinti dalies polimero praradimu filtracijos metu. Dinaminės viesos sklaidos rezultatai parodė, kad dalelių pasiskirstymas yra bimodalinis . Susintetintų nanodalelių dydis siekė 133 nm (6 lentelė).

24 pav. MSC eliucijos kreivės (kairėje) (detektuota su viesos sklaidos (LS) ir lū˛io rodiklio (RI) jutikliais) bei makromolekulių ir nanodalelių hidrodinaminių spindulių pasiskirstymo kreivės (deinėje)

5 lentelė. Junginio CHZ-AR (PL 10%)-CPAD (PL 12%) DLS rezultatai

Intensyvumas	R_h, nm

CHZ-AR (PL 10 %) buvo modifikuotas ir kitu hidrofiliniu GPA agentu – 4-ciano-4-(dodecilsulfaniltiokarbonil) sulfanilpentano rūgtimi TTR (25 pav.).

25 pav. ¹H-BMR spektrai CHZ-AR (PL 10 ) (1), CHZ-AR (PL 10 )-TTR (2)

Susintetinti RAFT makroiniciatoriai buvo panaudoti RAFT polimerizacijai valdyti (26 pav.). Kadangi reakcija vykdyta vandeninėje terpėje, tai iniciatoriumi buvo naudotas ACPR, nes jis tirpus vandeniame tirpale, ko negalima pasakyti apie AIBN. Sintezės metu siekta susintetinti hidrofilines nanodaleles, todėl pasirinktas monomeras HEMA. Jis yra hidrofilinis kaip ir chitozanas. Be to, is monomeras gerina sintetinamų produktų adheziją prie substratų.

26 pav. RAFT makroiniciatoriaus sintezė bei HEMA RAFT polimerizacija

Apie tai, kad HEMA polimerizacija vyko galima spręsti i H BMR spektrų (27 pav.): atsiradęs signalas ties 4,15 m.d. yra būdingas HEMA esančios –CH₂-O-C(=O)-R grupės protonams.

27 pav. CHZ-AR (PL 10 ) (1), CHZ-AR (PL 10 )-CPAD (PL 12 ) (2) ir CHZ-AR (PL 10 )-CPAD (PL 12 )-PHEMA (3) ¹H-BMR spektrai

IVADOS

l I chitozano ir dikarboksirūgčių karbodiimidiniu metodu susintetintos vandeniniuose tirpaluose tirpios chitozano nanodalelės, kuriose chitozano pakeitimo laipsnis kinta nuo 7 iki 22 %

l DLS metodu nustatyta, kad susintetintų nanodalelių hidrodinaminis spindulys R_h kinta nuo 230 iki 850 nm. Greta nanodalelių yra ir modifikuoto chitozano makromolekulių, kurių R_hkinta nuo 7 iki 25 nm.

l Prie chitozano ir karboksirūgtimis modifikuotų chitozano nanodalelių prijungus (4-cianpentano rūgties)-4-ditiobenzenkarboksilatą (CPAD) arba 4-ciano-4-(dodecilsulfaniltiokarbonil) sulfanilpentano rūgtį (TTR), susintetinti makroiniciatoriai gyvybingajai radikalinei polimerizacijai RAFT metodu.

l Grį˛tamosios jungimosi-fragmentacijos grandinės perdavos (RAFT) polimerizacijos metodu chitozano nanodalelės “aprengtos” polihidroksietil metakrilato sluoksniu.

VILNIUS UNIVERSITY

FACULTY OF CHEMISTRY

DEPARTMENT OF POLYMER CHEMISTRY

Synthesis and study of chitosan-based nanoparticles

SUMARRY

In recent studies, a huge attention is paid to natural polymer chitosan and its application in medicine as drug or gene carrier.

Chitosan is produced from chitin – the second most popular biopolymer – by deacetylation reaction. The most important chitosan properties are nontoxicity, biodegradability and facile modification through amine group. The present work deals with the synthesis of chitosan-based nanoparticles via carbodiimide induced coupling between amino groups of chitosan and carboxyl groups of di- and trifunctional acids resulting in amide linkages. The synthesized chitosan derivatives were characterized by FT-IR and ¹H-NMR spectroscopy and solution viscometry. Molecular weight of the copolymers was determined by gel permeation chromatography, and the size of nanoparticles was measured by dynamic light scattering. The size distribution of the modified chitosan was bimodal suggesting hydrodynamic radius of the nanoparticles in the range from 170 to 850 nm and that of separate macromolecules in the range 10 to 55 nm.

Further, chitosan nanoparticles were modified with RAFT chain transfer agents (CTA) CPAD and TTR resulting in macro-CTA. RAFT polymerization of the hydrophilic monomer HEMA in the presence of chitosan nanoparticles as macro-CTA resulted in hydrophilic nanoparticles which can be used in bionanotechnology and biomedicine.

LITERATŪROS SĄRAAS:

Nalwa H. S., Polymeric nanostructures and their applications. Los Angeles:American Scientific Publishers, 2007.

Crini G. , Badot P.-M. Application of chitosan, a natural aminopolysaccharide, for dye removal from aqueous solutions by adsorption processes using batch studies: A review of recent literature. Progress in Polymer Science, , , p. 399-447.

Speičienė V., Sekmokienė D. Chitozanas ir jo pritaikymas maisto pramonėje (ap˛valga). Maisto chemija ir technologija, 2005, 39 (1), p. 68-72.

Kean T, Roth S, Thanou M. Trimethylated chitosans as non-viral gene delivery vectors: cytotoxicity and transfection efficiency. J Control Release, 2005, (3), p. 643–53.

Mark H. F. Encyclopedia of Polymer Science and Technology, 3rd ed. USA: John Wiley and Sons Inc., 2003.

Chen P.H, Kuo T.Y., Liu F.H., Hwang Y.H., Ho M.H., Wang D.M., Lai J.Y., Hsieh H.J. Use of dicarboxylic acids to improve and diversify the material properties of porous chitosan membranes. J. Agric. Food Chem., p. 9015-9021.

Schwartz M. Smart Materials. CRS press, Taylor and Francis group, 2009.

Aranaz I., Harris R., Heras A. Chitosan amphiphilic derivatives. Chemistry and applications. Current Organic Chemistry, 2010 p. 308-330.

Stuart b. H. Polymer analysis. John Wiley and Sons Inc., 2003.

Braun D., Cherdron H., Ritter H.. Polymer synthesis: theory and practice. Fundamentals, methods, experiments, 3rd ed. Germany: Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2001.

Christian P., Kammer F. Baalousha M., Hofmann Th. Nanoparticles: structure, properties, preparation and behaviour in environmental media. Ecotoxicology, 2008, 17, p. 326-343.

Bouwmeester H., Dekkers S., Noordam M. Y., Hagens W. I., Bulder A. S., Heer C., Voorde S., Wijnhoven A. W.P., Marvin H. J.P.,. Sips A. J.A.M. Review of health safety aspects of nanotechnologies in food production. Regulatory Toxicology and Pharmacology, , , p.52-62.

Silva G. A., Ducheyne P., Reis R. L. Materials in particulate form for tissue engineering. 1. Basic concepts. J. Tissue Eng. Regen. Med, 2007, 1, p. 4-24.

Gaucher G., Marchessault R. H., Leroux J.C. Polyester-based micelles and nanoparticles for the parenteral delivery of taxanes. Journal of Controlled Release, , p. 2-12.

Zonghua L., Yanpeng J., Yifei W., Changren Z., Ziyong Z.. Polysaccharides-based nanoparticles as drug delivery systems.Advanced Drug Delivery Reviews, 2008, 60, p. 1650-1662.

Bodnar M., Hartmann J.F., Borbely J.. Preparation and characterization of chitosan-based nanoparticles. Biomacromolecules, 2005, 6, p. 2521-2527.

https://en.wikipedia.org/wiki. Raktiniai ˛od˛iai: Carbodiimide, Dicyclohexylcarbo diimide, N,N-Diisopropylcarbodiimide, 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide. ˇiūrėta: 2010 03 12.

Berger J., Reist M., Mayer J. M., Felt O., Peppas N. A., Gurny R. Structure and interactions in covalently and ionically crosslinked chitosan hydrogels for biomedical applications. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, , p. 19-34.

York A. W., Kirkland S. E., McCormick C. L. Advances in the synthesis of amphiphilic block copolymers via RAFT polymerization: Stimuli-responsive drug and gene delivery. Advanced Drug Delivery Reviews, 2008, 60, p. 1018–1036.

Perrier, S., Takolpuckdee, P. Macromolecular design via reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT)/xanthates (MADIX) polymerization. Journal of Polymer Science: Part A: Polymer Chemistry, 2005, 43, p. 5347-5393.

Boyer C., Bulmus V., Davis T. P., Ladmiral V., Liu J., Perrier S. Bioapplications of RAFT Polymerization. Chem. Rev., p. 5402–5436.

Leidinys internete: https://www.actim.com/content/view/25/38/lang,en/. ˇiūrėta: 2010 03 15.

Pottorf R. S., Szeto P., 1-Ethyl-3-(3′-dimethylaminopropyl)carbodiimide Hydrochloride. 2001 04. Adresas: https://www.mrw.interscience.wiley.com/eros/articles/re062/ frame.html. ˇiūrėta: 2010 03

Alfrey, T., Fuoss, R. M., Morawetz, H., Pinner, H. Amphoteric Polyelectrolytes. II. Copolymers of Methacrylic Acid and Diethylaminoethyl Methacrylate. Journal of the American Chemical Society, 1952, 74, p. 438-441

Leidinys internete: https://www.strem.com/uploads/resources/documents/raft.pdf. ˇiūrėta: 2010 04 20.

Ofortas - tai grafikos technika, spaudos būdas, irastas XVII a. Būdinga viesių-tamsių tonų deriniai, subtilus trichavimas, laisvas pieinys

NIPAAm – N-izopropilakrilamidas

Politica de confidentialitate | Termeni si conditii de utilizare

DISTRIBUIE DOCUMENTUL

Vizualizari: 3070
Importanta:

Comenteaza documentul:

Te rugam sa te autentifici sau sa iti faci cont pentru a putea comenta

Creaza cont nou

Distribuie URL
https://www.scrigroup.com/limba/lituaniana/249/CHITOZANO-NANODALELI-SINTEZ-IR83783.php

Adauga cod HTML in site
<a href="https://www.scrigroup.com/limba/lituaniana/249/CHITOZANO-NANODALELI-SINTEZ-IR83783.php" target="_blank" title=" - https://www.scrigroup.com/limba/lituaniana/249/CHITOZANO-NANODALELI-SINTEZ-IR83783.php">Chitozano nanodaleliŲ sintezĖ ir tyrimas - bakalauro studijų baigiamasis darbas</a>