TEHNICILE DE OBTINERE ALE PREPARATULUI HISTOLOGIC

TEHNICILE DE OBTINERE ALE PREPARATULUI HISTOLOGIC

ETAPELE OBTINERII PREPARATULUI HISTOLOGIC PERMANENT

REZULTATELE COLORARII, EXAMINAREA LA MICROSCOP A PREPARATELOR REALIZATE IN COLORATII DIFERITE

TEHNICA EFECTUARII PREPARATELOR

Examinarea morfo-functionala a celulelor se face pe preparate microscopice.

Un preparat microscopic este reprezentat de proba de studiat asezata pe o lama de sticla si acoperita cu o lamela.

-lama, se mai numeste si  lama port-obiect  cu laturi paralele si dimensiuni de 76/26mm si 1.5-2mm grosime.

- lamela este din sticla , are forma patrata sau dreptunghiulara, cu dimensiuni variabile de 18/18, 22/22 sau 22/32mm si o grosime de 0.16-0.18mm.

-Proba de studiat este reprezentata de un fragment de tesut sau o cantitate mica dintr-un lichid corporal, aduse prin sectionare, respectiv etalare la o grosime de cativa microni. ; la aceasta grosime, lumina strabate proba-(transiluminare)-permitand studierea celulelor la microscopul optic. .

In functie de starea celulelor de studiat, preparatele microscopice se clasifica in :

Preparate proaspete , temporare sau extemporanee

Preparate permanente sau durabile, care permit un studiu amanuntit al celulelor pe piese fixate si colorate; ele rezista in timp si se pot realiza prin:

a)-metoda efectuarii sectiunilor fine

b)-metoda etalarii materialului biologic in monostrat (frotiu, amprente de organ)

Preparatele proaspete, temporare sau extemporanee, le realizam atunci cand vrem sa studiem structura unui tesut sau organ in stare vie.

In acest scop se recolteaza din organismul animal in timpul vietii (biopsie) un fragment foarte subtire de organ sau tesut pe care-l disociem pe lama intr-un lichid natural sau artificial, favorabil mentinerii vietii celulelor in timpul examinarii (plasma, limfa, lichid amniotic, ser fiziologic).

Acoperim apoi preparatul cu o lamela ale carei margini le lipim cu parafina topita, pentru a evita uscarea tesutului.

Acest tip de preparat se mai foloseste si in studiul culturilor de tesuturi. Pe astfel de preparate proaspete extemporanee, putem examina celulele sau elementele tesutului respectiv necolorate sau colorate printr-o metoda numita coloratie vitala.

In metoda coloratiei vitale se intrebuinteaza diferite substante colorante putin toxice, care nu altereaza viata celulelor.

Colorantii vitali se impart in :

Colorantii vitali bazici

Colorantii vitali acizi

Examenul in stare vie sau proaspata are marele avantaj de a permite studiul celulelor in viata, de a urmari diferite aspecte functionale ale acestora in desfasurarea lor, de a studia unele aspecte ale dinamicii celulare.

Putem observa :

-miscarea cililor, miscarea ameboida

-contractilitatea, fagocitoza, fecundatia, segmentarea ovulului.

Cu toata simplitatea si avantajul pe care-l ofera acest procedeu, examenul in stare proaspata are aplicativitate restransa. Marele dezavantaj al acestei metode este alterarea tesutului de examinat.

De aceea s-a ajuns la necesitatea de a avea preparate microscopice durabile, permanente care sa permita un studiu amanuntit si de lunga durata pe piese conservate si colorate.

2. Preparate permanente sau durabile,

a)-metoda efectuarii sectiunilor fine

Sectiunea este un preparat permanent in care se urmareste mentinerea tesuturilor cat mai asemanatoare cu aspecutul lor din timpul vietii si durabilitatea in timp.

Obtinerea sectiunilor necesita efectuarea unor timpi operatori succesivi, fiecare dintre ei avand o influenta hotartaoare asupra reusitei finale. In ordinea executarii lor acestia sunt:

-recoltarea

-fixarea

-spalarea

-decalcifierea (in cazul tesuturilor dure)

-includerea

-sectionarea

-aplicarea sectiunilor pe port-obiect

-colorarea

-montarea

-etichetarea

Recoltarea si orientarea pieselor

Fragmentele de organe sau tesuturi trebuiesc recoltate in timpul vietii, (printr-o interventie chirurgicala, cand se obtine o piesa operatorie, fie printr-un act operator mai redus, biopsie, cand se obtine un mic fragment de tesut, fragment bioptic) sau imediat dupa moartea animalului, pentru a evita modificarile cadaverice. Apoi, fara a le deforma sau strivi, sunt taiate la o grosime de 2-3 mm si orientate astfel incat sa permita un studiu cat mai complet. (Ex sectiune prin colon, nu vom face sectiunile longitudinal, sa prindem doar epiteliul de acoperire, ci transversal sa prindem toate straturile). Piesa de material bioptic trebuie sa aiba fete plane si paralele, sa nu aiba grosime mai mare de 1-4 mm, pentru a facilita patrunderea rapida a fixatorului si a evita aparitia alterarilor post-mortem.

Recoltarea se face :

-pe o placa de pluta sau PVC

-cu pense fine pentru a nu strivi preparatul

-fasonarea piesei se face cu lame ascutite degresate ( daca tesutul recoltat este moale, de exemplu SNC, iar fasonarea poate produce strivirea pieselor, se vor fixa fragmente mai mari de tesut, apoi se fasoneaza).

Fixarea

Reprezinta un timp obligatoriu in realizarea preparatelor permanente. Are ca scop conservarea constituientilor celulari intr-o stare cat mai apropiata de cea din timpul vietii, conservand forma, structura si compozitia chimica precum si raporturile reciproce existente in stare vie si pregatirea lor in vederea manevrelor ulterioare (includere, colorare). Fixarea omoara si imobilizeaza celulele intr-un anume moment al activitatii lor.

Aceasta depinde in primul rand de proteine, principalii constituienti ai materiei vii, ceea ce inseamna ca un bun fixator histologic trebuie sa fie in primul rand un bun fixator al proteinelor. Mecanismul fixarii proteinelor nu este perfect cunoscut. Se cunoaste faptul ca fixatorii histologici determina o coagulare sau o insolubilizare a proteinelor si in majoritatea cazurilor un anumit grad de polimerizare a structurilor organice. O consecinta importanta a acestei coagulari a proteinelor este ca se realizeaza blocajul reactiilor enzimatice, impiedicand astfel digestia autolitica a tesuturilor.

Fixarea trebuie privita diferit in functie de :

-gradul conservarii morfologice pe care dorim sa-l obtinem : fixarea se realizeaza in mod diferit pentru microscopia electronica fata de cea fotonica ; in primul caz trebuiesc pastrate relatiile intre constituientii celulei la scara moleculara.

-de natura constituientilor chimici ce trebuie conservati : anumite structuri macromoleculare sunt mai usor de conservat (de exemplu proteinele), in timp ce altii sunt foarte labili si dificil de fixat, (oligozaharidele).

-de volumul fragmentelor tisulare ce trebuiesc conservate : fixarea unui frotiu celular este diferita de cea a unui organ (de exemplu encefalul) unde patrunderea fixatorului devine elementul esential al fixarii.

-de tipul reactiilor histochimice sau de culoarea pe care dorim sa le efectuam : fixarea este diferita cand folosim o coloratie simpla, topografica sau cand incercam decelarea lipidelor sau enzimelor.

Un bun fixator trebuie sa indeplineasca urmatoarele conditii :

sa aiba putere mare de patrundere

sa produca o cat mai mica retractie a pieselor, evitand modificarea taliei, formei, raporturilor dintre celule

sa nu determine aparitia de artefacte, adica modificari ale piesei care nu corespund realitatii (retractari, umflari, vacuolizari)

sa confere o anumita consistenta piesei

sa permita colorarea pe care dorim sa o efectuam

sa nu fie toxic pentru cel care il manevreaza

sa depaseasca piesa ca volum de 30-40 de ori.

Fixarea se face cu agenti fizici sau chimici :

Agentii fizici utilizati : caldura, desicarea sau congelarea

Agentii chimici sunt cel mai frecvent utilizati, fie ca fixatori simpli, fie sub forma de amestecuri fixatoare.

Nici un fixator citologic nu este universal si de aceea arta fixarii consta in alegerea corecta a fixatorului in raport cu ceea ce trebuie studiat. Un fixator simplu, este greu sa indeplineasca toate calitatile necesare unei bune fixari, motiv pentru care se recurge la amestecuri fixatoare in care diversi compusi isi completeaza reciproc actiunea.

Reguli generale ale fixarii :

-Evitarea alterarilor autolitice- fixarea trebuie facuta cat mai repede posibil dupa recoltarea materialului biologic.

-Spalarea fragmentelor, intr-o solutie fiziologica. Nu se foloseste apa, deoarece produce umflarea tesuturilor.

-Evitarea uscarii tesuturilor, manevrele se fac in mediu umed.

-Facilitarea la maxim a penetrarii fixatorului in organe si tesuturi. Se vor utiliza vase mari, cu fundul plat si dop rodat, nu se va lasa sange sau mucus la suprafata piesei, se agita din timp in timp sa nu se lipeasca de peretii flaconului.

-Piesele se introduc in amestecul fixator ambalate in tifon si purtand numar de identificare.

-Durata fixarii, variaza in functie de compozitia agentului fixator, structura, dimensiunea pieselor.

-Un fixator odata folosit nu se va folosi la fixarea altei piese.

Tratamentul pieselor imediat dupa fixare

Cand se alege un fixator, se are in vedere structura ce va fi studiata, stiind ca anumite tesuturi si componente celulare implica folosirea anumitor fixatori sau contraindica folosirea altora.

Pentru glicogen nu se folosesc fixatori aposi.

Pentru fixarea grasimilor nu se folosesc solventi ai acestora.

Spalarea

Este operatiunea in care se opreste fixarea si se indeparteaza excesul de fixator si a unor eventuale structuri false ce pot apare in preparat datorita unor defecte de fixare.

Se poate face cu diferite substante in functie de fixatorul folosit :

-apa curgatoare pentru formaldehida

-alcool pentru fixatori cu dicromat de potasiu

-alcool absolut pentru fixatorii pe baza de alcool, amestecul Carnoy

La alcoolul in care spalam piesa se adauga in mod obligatoriu si solutie iod iodurata sau tinctura de iod pentru a se elimina precipitatele pe care le formeaza sublimatul in tesuturi in timpul fixarii.

Includerea

Este etapa in care piesa , odata fixata, este procesata intr-o forma care sa permita efectuarea de sectiuni subtiri. Aceasta se realizeaza prin inglobarea si impregnarea pisei cu o substanta solidificabila, rezultand un bloc cu consistenta solida, omogena.

Cel mai frecvent e utilizata parafina, cu o densitate asemanatoare tesuturilor, ce permite obtinerea de sectiuni cu grosimi de 3-10microni.

Alte substante folosite : celoidina, gelatina, iar pentru microscopia electronica rasinile sintetice.

Includerea la parafina- etape :

-deshidratarea

-clarificarea

-impregnarea cu parafina

-includerea propriu zisa

Deshidratarea este operatiunea in care se indeparteaza apa din piesa. Acest pas este necesar deooarece parafina nu e solubila in apa.

De obicei de face cu alcool in bai de concentratii succesiv crescute (70%, 95% si 100%). In acest fel alcoolul inlocuieste treptat apa din tesuturi.

Volumul alcoolului din baia de deshidratare trebuie sa fie de aproximativ 10 ori mai mare decat volumul piesei.

Durata depinde marimea fragmentelor, in medie de 2-3 ore pentru fiecare baie de alcool. Ultima baie trebuie sa se faca intotdeauna in alcool absolut nou.

Clarificarea, este operatiunea in care alcoolul din piesa este inlocuit cu o substanta care are proprietatea de a fi miscibila atat cu alcoolul cat si cu parafina.

Dintre aceste substante mentionam xilenul, benzenul, toluenul, cloroformul. Cel mai folosit e xilenul.

Clarificarea consta , de asemenea in bai succesive de aceeasi substanta , de obicei 3 bai de xilen cu durata de 3-6 ore in functie de marimea fragmentului.

La sfarsitul operatiunii de carificare, piesa devine translucida.

Impregnarea la parafina- se utilizeaza parafina cu punct de topire 56C, care e mentinuta la aceasta temperatura printr-un termostat.

Se trec piesele prin cel putin 3 bai de parafina pentru a se indeparta orice urma de solvent din piese.

Includerea propriu -zisa, sau turnarea blocului, consta in inglobarea pieselor in parafina noua, neutilizata, turnata intr-o forma ; frecvent se folosesc barele paralele Leuckhardt. Piesa se introduce in parafina topita cu fata care va fi sectionata spre fundul formei. Prin racire la temperatura camerei blocul se solidifica si va putea fi sectionat.

Exista inconveniente pentru preparatele ce contin mult tesut conjuntiv, care se sectioneaza greu. Recomandat a se folosi incluziune in celoidina.

Sectionarea

Piesele histologice pot fi sectionate :

a)-imediat dupa fixare, fara a fi incluse

b)-imediat dupa ce au fost incluse

a)Sectionarea piesei neincluse se face in mod curent in urma intaririi ei prin congelare sub actiunea vaporilor de bixid de carbon, proveniti dintr-o bomba mecanica, pusa in legatura printr-un ventil cu un microtom special pentru acest scop, numit microtom pentru sectiuni de gheata.

Sectionarea la gheata este foarte expeditiva si este folosita in histologie, in histochimie, histoenzimologie. Cu ajutorul ei se usureaza punerea in evidenta a unor componenti celulari : grasimi, enzime, care dispar in metodele de incluziune. Sectiunile sunt in general groase, mai mari de 10 microni.

b)Sectionarea pieselor incluse la parafina se realizeaza cu ajutorul unui alt tip de microtom. Acesta are la baza un cutit foarte ascutit prevazut cu un mecanism care se deplaseaza de-a lungul blocului inclus in parafina, avansand cu o distanta standard. Prin miscarea repetata a blocului in lungul cutitului se obtin sectiuni seriate, de cativa microni (obisnuit 4-6), care adera una de alta, formand o panglica.

Etalarea

Este o operatiune prin care sectiunile se aplica pe lama portobiect bine degresata. Pe lama de sticla se aplica o picatura de albumina Mayer sau solutie apoasa de gelatina si se intinde bine de-a lungul lamei.

Din panglica de sectiuni se taie fragmente de 3-4 care se aplica cu fata lucioasa pe suprafata unsa cu albumina Mayer a lamei. Se picura apa distilata la una din extremitatile panglicii astfel incat sectiunile sa pluteasca, apoi se aseaza pe o platina incalzitoare, unde, in cateva secunde, sectiunile se descretesc si se intind complet. Lamele se tin apoi, 24 de ore la termostat, 37C, pentru ca sectiunile sa se usuce si sa se lipeasca.

Astfel procesate, preparatele permanente pot fi pastrate necolorate, ferite de praf si lumina timp indelungat.

Amestecuri fixatoare frecvent folosite

Agentii Fixatori

Decalcifierea

Pentru a efectua preparate din piese ce contin in ele formatiuni impregnate cu saruri de calciu, cum sunt oasele sau dintii este necesar dupa fixare sa procedam la decalcifierea acestora.

Dupa fixare, spalam bine piesa in apa curgatoare, respectiv cu alcool, apoi o trecem printr-o serie de alcooluri cu concentratii crescande pana la 96, apoi din nou in apa. Apoi se trece la decalcifiere. Piesele sunt trecute prin cateva bai de solutie decalcifianta pana se demineralizeaza.. Dupa decalcifiere, piesele sunt trecute pentru neutralizare printr-o solutie de sulfat de Na 5% timp de 24h, apoi bine spalate in apa curgatoare, 48h.

Unii fixatori, Bouin, Zenker, actioneaza si ca solutii decalcificatoare dar doar la piese foarte mici.

Consideram incheiata decalcificarea cand piesele sunt moi si se pot taia usor.

Dupa decalcificare, piesa e supusa tehnicii de impregnare ca orice alt tesut necalcificat.

Colorarea sectiunilor

Sectiunile piselor incluse in parafina si lipite pe lama, nu pot fi colorate in aceasta stare , deoarece solutiile colorante nu le pot patrunde , din cauza parafinei cu care a fost impregnata piesa in timpul incluziei. De aceea aceste sectiuni trebuiesc in prealabil deparafinate si apoi hidratate pentru a le face apte de a fi colorate cu diferite substante colorante , care sunt folosite in majoritatea lor , in solutii apoase.

Deparafinarea, se face prin trecerea lamelor pe care sunt lipite sectiunile , prin 3 bai successive care contin unul din solventii parafinei amintiti la incluzie, xilen, benzene, toluene, pentru a elimina parafina.

In fiecare vas cu xilen se va tine lama aproximativ 1, 3 minute. Apoi, lamele sunt trecute mai departe prin 3 bai de alcool de 96 cu scopul de a elimina solventul parafinei.. In fiecare baie de alcool, lama va fi lasata 1, 2 minute.

In sfarsit, lamele sunt cufundate intr-un vas cu apa pentru a fi rehidratate sectiunile.

Colorarea propriu zisa, ocupa un loc important in tehnica histologica. In stare vie, constituientii tisulari , au indici de refractie practic asemanatori, din care cauza la examenul cu microscopul obisnuit apar omogeni. La fel raman tesuturile si dupa fixare. Principiul coloratiei histologice este de a folosi substante colorante care se combina in mod selectiv numai cu una sau o parte din structurile unui tesut , pe care in acest fel le pune in evidenta. Folosirea a doi sau mai multi coloranti intr-o metoda va da o imagine de ansamblu diferentiata a diferitilor componenti tisulari.

Clasificari coloranti

1.Colorantii folositi in histologie sunt de doua feluri dupa modul de obtinere

-naturali (hematoxilina, colorant de origine vegetala, carminul, colorant de origine animala)

-artificiali

2.Dupa capacitatea de actiune a gruparilor continute se clasifica in :

-coloranti acizi , care coloreaza structurile celulare cu reactie alcalina, cum sunt citoplasmele. Exemple : eozina, fuxina acida, orange G, albastrul de anilina, verdele de lumina.

- coloranti bazici, ce coloreaza structurile nucleare. Exemple :albastrul de metil, fuxina bazica, hemalaunul, albastrul de toluidina.

- coloranti neutri, ce rezulta dintr-un amestec in anumite proportii dintr-un colorant acid cu unul bazic si coloreaza diferite incluziuni citoplasmatice cu reactie neutra. Exemple : eozinatul de albastru de metilen.

- coloranti indiferenti, nici acizi ,nici bazici, nnici neutri, ei actionand printr-un fenomen fizic de absorbtie pe un substrat tisular. Exemple : Sudan III, ce loreaza grasimile in rosu-portocaliu.

3.Dupa modul in care se realizeaza coloratia se clasifica in

-coloratii progresive, in care coloratia se face progresiv, urmarind rezultatul

-coloratii regresive, in care se realizeaza supracolorarea, apoi se scoate excesul de colorant cu ajutorul unor substante diferentiatoare.

4.Dupa numarul colorantilor folositi se clasifica in

-coloratii simple : presupun folosirea unui singur colorant. Exemple : albastrul de metilen

-coloratii combinate : presupun folosirea a 2-3 coloranti, atat nucleari cat si citoplasmatici.

5.Dupa modul in care colorantul actioneaza asupra tesuturilor se clasifica in:

-coloranti directi

-coloranti indirecti sau prin mordansare

6.Dupa afinitatea electiva a colorantului pentru anumite structuri tisulare, se clasifica in:

-ortocromatici, coloreaza structurile in aceeasi culoare cu a lui

-metacromatici, coloreaza structurile in alta culoare

Din multiplele metode si procedee de colorare in histologie vom indica aici una din cele mai raspandite metode in practica curenta, coloratia hematoxilin-eozina

Solutiile care contin acesti coloranti trebuiesc preparate anterior. Formula cea mai intrebuintata de preparare este:

-hematoxilina, 1g

-iodat de potasiu, 0.2g

-alaun de potasiu, 50g

-apa distilata, 1000cc

Se dizolva intai alaunul de potasiu in apa, apoi se adauga hematoxilina si la urma se pune iodatul de potasiu pentru a grabi oxidarea hematoxilinei. Eozina se foloseste in solutie apoasa de 1%.

Timpii coloratiei :

Sectiunile deparafinate si hidratate sunt introduse succesiv in :

solutie de hemalaun, 5-10 min.

spalare in apa curgatoare, 5-10 min.

solutie de eozina, 1-2min.

spalare in apa distilata, cateva secunde

deshidratare in alcool de 96s si alcool absolute

xilen fenicat, pentru clarificare, 5-10 min.

clarificare in xilen pur, cateva minute.

montare, se pune pe sectiunea colorata si clarificata o picatura de balsam de Canada si se acopera cu o lamela de marime potrivita.

Rezultate :

nuclei, albastru-violet

nucleoli, rosu

citoplasma, roz

granulatiile bazofile, albastriu-violet

granulatii acidofile, rosu caramiziu

matricea cartilaginoasa si osoasa, roz intens

Coloratiile tricromice, rezultate :

Coloratii speciale

Unele tehnici se folosesc pentru evidentierea anumitor structuri :

-evidentierea grasimilor : Sudan III, se coloreaza in rosu -portocaliu, Sudan IV, se coloreaza in negru.

-evidentierea glicogenului

-impregnare argentica, pentru sistemul nervos si fibrele de reticulina

-orceina, pentru fibrele de elastina

-mucicarmin si albastru alcian pentru mucus

-verde de metil pironina pentru plasmocite

-violet de cresyl pentru corpii Nissl din neuron

-PAS, pentru evidentierea fibrelor de reticulina, epitelii glandulare

-Maz Grunwald-Giemsa, pentru granulocitele sanguine

-coloratiile tricromice pentru fibrele de colagen